苯丙氨酸乙酯修饰海藻酸钠纳米粒的制备及应用

论文摘要

本论文以苯丙氨酸乙酯为疏水基团,制备了疏水修饰的海藻酸钠-苯丙氨酸乙酯（SA-PE,SP）耦合物,研究了这种两亲性分子在水溶液中的自组装行为;以维生素B2（VB2）为模式营养物制备了载药的海藻酸钠纳米粒（VB2-SP）,研究了其在体外的药物缓释效果;以人结肠癌细胞Caco-2为模型细胞,考察了纳米粒的细胞毒性,并探讨了细胞对纳米粒的摄取机制以及影响因素。利用EDC和NHS作为交联剂,通过酰胺键共价连接苯丙氨酸乙酯（L-Phenylalanine ethyl ester, PE）到海藻酸钠（sodium alginate, SA）上制备SP化学耦合物,并改变苯丙氨酸乙酯与海藻酸钠的反应摩尔比制成三种不同取代度的样品（SP1、SP2、SP3）。利用核磁共振和红外光谱检测证明了产物的结构;利用元素分析仪测定了产物的取代度,每100个单糖分子约含有3.5-4.7个PE分子;通过超声法制备SP纳米粒悬液,利用动态激光散射、透射电子显微镜和荧光光谱技术对纳米粒的理化性质进行了测定,纳米粒的粒径随取代度增加而减小,粒径分布为226.7-425.3nm,纳米粒近似球形,形态完整;SP纳米粒的临界聚集浓度（CAC）随着取代度的升高而降低,SP1,SP2和SP3的CAC值分别是:0.20mg/ml、0.12mg/ml、0.10mg/ml。以VB2为模式营养物,利用超声法将VB2包被到纳米粒中,制备载药纳米粒（VB2-SP）。随着加药量的提高,SP纳米粒的包封率降低,载药量提高,SP1纳米粒的最大载药量为12.76±1.22%;随着取代度的升高,包封率和载药量都有提高。VB2-SP的缓释通过透析的方法进行研究,48h内SP纳米粒对VB2具有良好的缓释效果;VB2的释放量受取代度和pH的影响,取代度越高,缓释效果越好;相对于pH7.4,VB2-SP在pH2.0条件下释放更为缓慢;SP纳米粒适合作为营养物质VB2的载体。利用MTT法测定不同取代度的空白SP纳米粒细胞毒性,并利用荧光酶标仪与激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）研究Caco-2细胞对于荧光标记SP纳米粒的摄取情况。结果表明,除了1mg/ml的SP3纳米粒,其他SP纳米粒对于Caco-2细胞无显著毒性,24h后存活率仍在95%以上;细胞对纳米粒的摄取率受取代度、纳米粒浓度、孵育时间和温度的影响,在高取代度低浓度较长孵育时间条件下,细胞对纳米粒具有高的摄取率;4h内大约有60%的SP纳米粒被Caco-2细胞摄取;4℃下细胞对纳米粒的摄取受到抑制;激光共聚焦扫描显微镜结果显示SP纳米粒能被Caco-2细胞摄取。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 0 前言
• 0.1 营养物质纳米运送系统
• 0.1.1 营养物质纳米运送系统简介
• 0.1.2 用于营养物质的纳米运送系统的优点
• 0.1.3 纳米载体的制备方法
• 0.1.4 纳米营养运送系统中载体的种类
• 0.1.5 小结
• 0.2 双亲性聚合物
• 0.2.1 双亲性聚合物简介
• 0.2.2 疏水化多糖纳米粒的特点
• 0.2.3 疏水化多糖纳米粒的应用
• 0.3 海藻酸钠
• 0.3.1 海藻酸钠钠结构和性性质
• 0.3.2 海藻酸钠的应用
• 1 海藻酸钠-苯丙氨酸乙酯耦合物的合成及自聚集纳米粒的制备与表征
• 引言
• 1.1 材料
• 1.1.1 药品与试剂
• 1.1.2 仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 SA-PE（SP）耦合物的制备
• 1H 核磁共振光谱分析'>1.2.2 SP 耦合物的¹H 核磁共振光谱分析
• 1.2.3 SP耦合物的红外光谱分析
• 1.2.4 元素分析仪测定产物取代度
• 1.2.5 SP自聚集纳米粒的制备
• 1.2.6 纳米粒的平均粒径大小及其分布
• 1.2.7 透射电子显微镜（TEM）观察纳米粒外观
• 1.2.8 SP 纳米粒临界聚集浓度（CAC）的测定
• 1.3 结果与讨论
• 1.3.1 SP 耦合物的合成及性质
• 1.3.2 SP 耦合物的取代度
• 1.3.3 SP 纳米粒的制备及自组装行为的研究
• 1.3.4 SP 纳米粒的外观和粒径分布
• 1.3.5 SP 纳米粒溶液的荧光光谱和临界聚集浓度
• 1.4 小结
• 2 海藻酸钠-苯丙氨酸乙酯载药纳米粒的制备与维生素82的体外释放研究
• 引言
• 2.1 材料
• 2.1.1 试剂
• 2.1.2 仪器
• 2.2 方法
• 2 标准曲线的绘制'>2.2.1 VB₂标准曲线的绘制
• 2.2.2 载药SP 纳米粒的制备
• 2.2.3 载药SP 纳米粒的包封率和载药量的计算
• 2-SP 纳米粒的体外药物缓释'>2.2.4 VB₂-SP 纳米粒的体外药物缓释
• 2.3 结果与讨论
• 2 标准曲线的绘制'>2.3.1 VB₂标准曲线的绘制
• 2-SP 纳米粒的包封率和载药量'>2.3.2 VB₂-SP 纳米粒的包封率和载药量
• 2-SP 纳米粒的的体外释放'>2.3.3 VB₂-SP 纳米粒的的体外释放
• 2.4 小结
• 3 海藻酸钠-苯丙氨酸乙酯纳米粒细胞摄取的研究
• 引言
• 3.1 材料
• 3.1.1 药品与试剂
• 3.1.2 仪器
• 3.1.3 培养液及配置
• 3.1.4 Caco-2 细胞的冻存及复苏
• 3.1.5 细胞计数
• 3.2 方法
• 3.2.1 细胞的传代与培养
• 3.2.2 SP 纳米粒的细胞毒性
• 3.2.3 荧光标记SP 纳米粒的制备
• 3.2.4 荧光标记纳米粒的体外细胞摄取研究
• 3.2.5 细胞对SP 纳米粒摄取的激光共聚焦扫描显微镜观察
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 SP 纳米粒的毒性试验
• 3.3.2 细胞对SP 纳米粒摄取的定量研究
• 3.3.3 细胞对SP 纳米粒摄取的激光共聚焦扫描显微镜观察结果
• 3.4 小结
• 总结
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果