鸡大肠杆菌1型菌毛的抗原性分析及pi/A基因表达载体构建

论文摘要

将菌毛化的鸡大肠杆菌国内分离株GL7（078）灭活后作为免疫原,用淋巴细胞杂交瘤技术,经间接酶联免疫吸附试验（ELISA）和直接凝集试验（DA）二次筛选,获得4株能稳定分泌1型菌毛抗体的杂交瘤细胞,它们均为IgG。免疫印迹试验结果表明:4株单抗均能同鸡大肠杆菌1型菌毛反应,识别分子量为17-17.5KDa的菌毛蛋白。同时对鸡大肠杆菌表达1型菌毛的分离株进行检测,结果表明同—血清型或不同血清型间的鸡病原性大肠杆菌1型菌毛之间存在差异,O血清型不能完全体现菌株间的遗传相关性。 根据鸡源大肠杆菌1型菌毛结构基因pilA序列,在其保守区设计、合成了1对引物,经PCR扩增,从分属20个血清型的26个致病菌株染色体中均得到大小为657bp的阳性产物,经酶切、连接、转化,筛选所有菌株pilA基因阳性克隆,并分别测定其核酸序列。运用DNA-star分析软件对来源于该26株大肠杆菌1型菌毛的pilA基因序列进行分析,鸡源大肠杆菌1型菌毛大致存在3个不同类型。通过将基因序列翻译成氨基酸序列,并作抗原表位预测,与人源大肠杆菌1型菌毛进行比较,也发现鸡源大肠杆菌1型菌毛变异存在3种不同的类型,暂命名为1A型、1B型及1C型。在所测定的26个菌株中,属于1A型的菌株占23.1%（6/26）;1B型占26.9%（7/26）;1C型占50%（13/26）。这3种变异类型的氨基酸序列的相似性为91.35%-92.36%。其中1B型与1C型较为接近,1C型则接近于人源大肠杆菌1型菌毛。鸡源大肠杆菌1型菌毛变异类型与血清型关系不大。 将上述分别带有不同基因变异类型1型菌毛的鸡大肠杆菌GL7（O78,1A）,YR10（O18,1B）及MG10（O11,1C）培养提取菌毛制成单价1型菌毛油乳剂疫苗及含O78、O18、O11的多价1型菌毛灭活疫苗。4周龄SPF鸡分组分别免疫接种3种单价菌毛油乳剂疫苗,分别隔离饲养至6周

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 一、鸡大肠杆菌1型菌毛特性研究进展
• 1 概述
• 2 1型菌毛的一般特点及与P型菌毛的比较
• 3 1型菌毛的粘附机制
• 4 1型菌毛基因簇结构及其基因型
• 5 1型菌毛蛋白免疫原性
• 参考文献
• 二、鸡大肠杆菌GL7株（078）1型菌毛单克隆抗体研制及对野生分离菌株的检测
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株及来源
• 1.2 试验动物及细胞系
• 1.3 主要试剂和器材
• 1.4 免疫原的制备
• 1.5 免疫程序
• 1.6 检测方法的建立
• 1.7 细胞融合及杂交瘤细胞的筛选
• 1.8 单抗腹水的制备
• 1.9 McAb的某些生物学特性检查
• 1.10 McAb的初步应用
• 2 结果与分析
• 3 讨论与小结
• 参考文献
• 三、鸡大肠杆菌1型菌毛基因类型与抗原性分析
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株
• 1.2 质粒及质粒提取
• 1.3 细菌染色体提取
• 1.4 1型菌毛pilA基因引物设计与合成
• 1.5 PCR扩增
• 1.6 PCR产物的克隆
• 1.7 感受态细胞制备
• 1.8 重组质粒转化
• 1.9 阳性克隆的筛选
• 1.10 PCR产物序列测定
• 1.11 1型菌毛蛋白结构基因DNA序列及氨基酸序列比较
• 1.12 菌毛蛋白的二级结构预测与比较
• 1.13 鸡大肠杆菌1型菌毛蛋白抗原位点预测与比较
• 2 结果与分析
• 3 讨论与小结
• 参考文献
• 四、鸡大肠杆菌1型菌毛疫苗交叉保护免疫试验
• 1 材料与方法
• 1.1 菌种
• 1.2 试验用鸡
• 1.3 菌毛提纯及菌毛亚单位苗制备
• 1.4 试验分组及免疫情况
• 2 结果与分析
• 3 讨论与小结
• 参考文献
• 五、鸡大肠杆菌1型菌毛蛋白结构基因（pilA）表达载体构建及表达产物免疫原性
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 方法
• 1.3 表达产物的纯化
• 1.4 重组表达产物油乳剂疫苗制备
• 1.5 免疫试验
• 2 结果
• 2.1 PCR产物电泳分析结果
• 2.2 pilA基因表达载体的构建
• 2.3 重组菌株表达产物SDS-PAGE分析
• 2.4 Western blot结果
• 3 讨论与小结
• 参考文献
• 附录：主要试剂的配制
• 研究结论