论文题目: 人类CTD磷酸酶UBCP1、Tim50L1及MCP1的克隆与功能研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 遗传学
作者: 郑桦锐
导师: 毛裕民
关键词: 克隆,磷酸酶,聚合酶,转录,蛋白酶体,泛素类似蛋白,定点突变,亚细胞定位,细胞凋亡,线粒体
文献来源: 复旦大学
发表年度: 2005
论文摘要: RNA聚合酶Ⅱ是真核生物中负责转录结构基因的多亚基复合体,其最大亚基含有一个独特的羧基末端结构域（C-terminal domain,CTD）,CTD的可逆磷酸化修饰在调控转录的起始、延伸、mRNA处理等活动中扮演重要角色。目前已确定的人CTD激酶有很多种,而CTD磷酸酶则只有FCP1、SCP1和PP1。 我们首先从人类胎脑cDNA文库以及多组织成人cDNA文库中克隆到4个可能的CTD磷酸酶基因UBCP1,Tim50L1,MCP1及DUH,它们编码的蛋白都含有与FCP1和SCP1相同的CTD磷酸酶催化结构域。UBCP1的cDNA全长2215bp,编码含318个氨基酸的蛋白。该基因定位在人类染色体5q33.3区域,含有11个外显子,跨度为22.7kb。UBCP1基因在各组织中的表达较广泛,在胎盘、肺、睾丸、卵巢组织中的表达量较高,而心、肝、肾、脾、直肠及外周血白细胞等组织的表达水平相对较低。EST分析、SAGE分析以及RT-PCR实验结果均一致地表明UBCP1在肿瘤组织中的表达水平显著上调,提示其与肿瘤具有相关性。原核表达的GST-UBCP1对磷酸酶通用底物pNPP具有磷酸酶活性,与FCP1和SCP1一样,其最适pH在5.0附近,且活性依赖于Mg2+。定点突变分析确定了6个对UBCP1磷酸酶活性有关键作用的保守氨基酸以及4个重要位点,大多数位点在FCP1及SCP1中也是高度保守的。提示UBCP1与FCP1及SCP1在结构及催化机理上的一致性。UBCP1对CTD具有明显的去磷酸化作用,并且优先作用于CTD重复序列中的第5位Ser,表明它是一个新的人类CTD磷酸酶并具有位点偏好性。除了CTD磷酸酶结构域,UBCP1的N端具有一个泛素类似结构域（ubiquitin-like domain,UBLD）,UBLD中含有一个蛋白酶体相互作用基序（proteasome-interacting motif,PIM）,提示UBCP1可能与蛋白酶体有相互作用。的确,我们通过酵母双杂交筛选到一个蛋白酶体的亚基HsN3,体外结合实验证明了UBCP1与HsN3相互作用的特异性,但UBLD对这种相互作用并不是必需的。绿荧光融合蛋白表达显示了UBCP1定位在细胞核内,并且UBLD对于UBCP1的入核有重要影响。在COS-7细胞中过表达UBCP1可导致细胞凋亡,提示过表达UBCP1抑制RNAPⅡ转录活性的可能性。 Tim50L1是Tim50的一个剪接体,它们的差异在于N端的不同,Tim50L1缺失了Tim50具有的信号肽及跨膜区,造成了细胞定位的显著差异,Tim50定位在线粒体膜上,而Tim50L1主要定位于细胞核。EST分析显示它有可能在某些肿瘤组织中特异表达。Tim50L1编码240个氨基酸,其磷酸酶性质与其他CTD磷酸酶有显著差异,它在pH4.5及8.0附近活性最高,最适离子是Mn2+,最适温度在60℃附近。Tim50L1也对磷酸化的CTD表现出明显的去磷酸化作用,说
论文目录:
摘要
Abstract
英文缩略词
第一章 前言
第二章 材料和方法
1． 材料与试剂
1．1 实验材料
1．2 试剂、酶类
1．3 菌株、质粒和细胞株
1．4 常用试剂配制
1．5 主要仪器设备
1．6 计算机软件及数据库
1．7 引物
2． 方法
2．1 cDNA文库的构建以及基因序列的测定
2．2 MTC Panel表达谱分析
2．3 重组质粒的构建
2．4 GST和His融合蛋白的原核表达纯化
2．5 GST融合蛋白与His融合蛋白的体外结合实验(GST-pull down)
2．6 酵母双杂交筛选与UBCP1和Tim50L1相互作用蛋白
2．7 通用底物的磷酸酶活性测定
2．8 CTD磷酸酶活性分析
2．9 真核细胞的培养和转染
2．10 免疫共沉淀
2．11 细胞凋亡检测
第三章 实验结果
第一节 UBCP1基因的克隆与功能研究
1． cDNA文库的构建及基因序列分析
2． UBCP1基因的染色体定位
3． UBCP1基因的表达谱分析
4． GST融合蛋白的原核表达
5． 磷酸酶活性的测定
6． 酶活性位点分析
7． UBCP1对CTD的去磷酸化作用
8． 亚细胞定位
9． UBCP1与RNA聚合酶II的免疫共沉淀
10． 酵母双杂交筛选与UBCP1相互作用蛋白
11． UBCPI对细胞凋亡的影响
第二节 Tim50L1的克隆与功能研究
1． Tim50L1基因的克隆及序列分析
2． Tim50L1基因的表达谱分析
3． Tim50L1的原核表达
4． 磷酸酶活性测定
5． Tim50L1对CTD的去磷酸化作用
6． Tim50L1的亚细胞定位
7． Tim50L1与RNAPII的荧光共定位
8． Tim50L1与 RNAPII的免疫共沉淀
9． Tim50L1对细胞凋亡的影响
10． 尝试酵母双杂交筛选Tim50L1相互作用蛋白
第三节 MCP1和DUH的功能研究
1． MCP1和DUH基因序列分析
2． MCP1和DUH的表达谱分析
3． MCP1和DUH的原核表达
4． MCP1的磷酸酶活性测定
5． MCP1对CTD的去磷酸化作用
第四章 讨论
1． UBCP1的功能探讨
2． Tim50L1的功能探讨
3． MCP1和DUH的功能探讨
4． 总结及展望
第五章 综述RNA聚合酶II CTD的可逆磷酸化调控
参考文献
攻读博士学位期间发表的论文
致谢
论文独创性声明
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发布时间: 2005-09-19
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