绞股蓝皂苷糖苷酶的分离纯化及酶性质的研究

论文摘要

本文以酶法转化绞股蓝皂苷为目的,对绞股蓝皂苷糖苷酶的提取、分离纯化、酶学性质、酶反应特异性进行了研究。微生物Absida sp. GYP4r菌经发酵得到的粗酶液,对其进行TLC法分析结果表明该酶具有活性,能将多糖基的绞股蓝皂苷转化为低糖基的绞股蓝皂苷。该酶经DEAE-cellulose DE52离子交换柱纯化后得到纯酶,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定纯酶的分子质量为68 kDa。酶性质研究结果表明,最适pH为5.0,最适温度为40℃,温度稳定范围为20～60℃,pH稳定范围为2.2-8.0。Na+、K+、Mg2+、Zn2+、Ca2+、Fe3+对该酶无明显作用,Cu2+对其有抑制作用。酶反应动力学研究表明该酶的Vmax为0.46 mmol/（L-h）,米氏常数Km为14.20 mmol/L。酶反应特异性研究证明,绞股蓝皂苷糖苷酶对黄酮类无水解作用。对绞股蓝皂苷有水解作用,对穿山龙薯蓣皂苷、黄芪皂苷、白头翁皂苷、柴胡皂苷、人参皂苷Re、朱砂根皂苷没有水解作用。绞股蓝皂苷糖苷酶与pNP系列底物反应结果表明,绞股蓝皂苷糖苷酶能水解pNP-α-D-Gal、 pNP-a-D-Glc、pNP-β-D-Glc,对pNP-β-D-Gal有一定的水解作用,经淀粉酶活力测定表明,绞股蓝皂苷糖苷酶基本上无水解淀粉的能力。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 绞股蓝的概况
• 1.1.1 绞股蓝的植物学特征
• 1.1.2 绞股蓝的地理分布
• 1.2. 绞股蓝的化学成分
• 1.2.1 皂苷类
• 1.2.2 其他化学成分
• 1.3 绞股蓝的药用价值
• 1.4 绞股蓝皂苷的理化性质及化学结构
• 1.4.1 绞股蓝的理化性质
• 1.4.2 绞股蓝的化学结构
• 1.5 绞股蓝皂苷的生物活性及其应用
• 1.6 绞股蓝皂苷的研究进展
• 1.6.1 绞股蓝皂苷提取、分离技术的研究进展
• 1.6.2 微生物酶转化绞股蓝皂苷的研究进展
• 1.7 本论文的主要研究内容
• 第二章 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验菌种
• 2.1.2 实验试剂
• 2.1.3 实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 培养基的配置及菌的培养
• 2.2.1.1 察氏培养基的配制及菌的培养
• 2.2.1.2 固体培养机的配制
• 2.2.2 绞股蓝皂苷糖苷酶粗酶液的提取
• 2.2.2.1 缓冲液的配制
• 2.2.2.2 粗酶液的提取
• 2.2.3 酶活力的测定
• 2.2.4 薄层层析法（TLC）
• 2.2.5 绞股蓝皂苷酶的分离纯化方法
• 2.2.6 SDS-PAGE法测定绞股蓝皂苷糖苷酶蛋白的分子质量
• 2.2.6.1 溶液的配制
• 2.2.6.2 胶的制备
• 2.2.6.3 样品的处理
• 2.2.6.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.2.7 绞股蓝皂苷糖苷酶性质的研究
• 2.2.7.1 酶反应最适pH及pH稳定性的研究
• 2.2.7.2 酶反应最适温度及温度稳定性的研究
• 2.2.7.3 酶反应米氏常数的研究
• 2.2.7.4 金属离子对酶的影响
• 2.2.8 绞股蓝皂苷糖苷酶反应的特性研究
• 2.2.8.1 酶与黄酮类底物反应特性的研究
• 2.2.8.2 酶与皂苷类底物反应特性的研究
• 2.2.8.3 酶与pNP系列底物的反应
• 2.2.8.4 绞股蓝皂苷糖苷酶的淀粉酶活力的测定
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 粗酶液的酶活力检测
• 3.2 绞股蓝皂苷糖苷酶的分离纯化
• 3.3 绞股蓝皂苷糖苷酶的纯度检验及分子质量的测定
• 3.4 酶反应最适pH及pH稳定性的研究
• 3.5 酶反应最适温度及温度稳定性的研究
• 3.6 金属离子对绞股蓝皂糖苷苷酶的影响
• 3.7 米氏常数的测定
• 3.8 酶反应的特异性研究
• 3.8.1 绞股蓝皂苷酶与黄酮类底物反应
• 3.8.2 绞股蓝皂苷酶与皂苷类底物反应
• 3.8.3 绞股蓝皂昔糖苷酶与pNP系列底物的反应
• 3.8.4 绞股蓝皂苷糖苷酶的淀粉酶活力的测定
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢