论文摘要
血管内皮生长因子-C（vascular endothelial growth factor-C,VEGF-C）和血管内皮生长因子-D（vascular endothelial growth factor-D,VEGF-D）是VEGF家族的新成员,是调节胚胎组织淋巴管生成和成熟个体淋巴管生理功能的细胞因子,又被称为淋巴管生长因子。它们与淋巴内皮细胞表面受体VEGFR-3结合,诱导实体瘤内或瘤周的淋巴管新生和/或淋巴管扩张,与乳腺癌及多种恶性肿瘤的淋巴道转移密切相关。RNA干扰（RNA interference,RNAi）,是一种以双链小RNA分子在mRNA水平关闭相应序列基因或使其沉默的过程。通过RNA干扰技术使VEGF-C基因沉默,不仅使我们对VEGF-C的作用机制及信号传导通路有进一步了解,同时也有可能成为乳腺癌基因治疗的又一有效工具。本研究首先利用RT-PCR技术检测了人乳腺癌组织和细胞株中VE6F-C基因的表达情况,发现恶性肿瘤组织中VEGF-C基因表达明显高于癌旁组织和良性肿瘤。实验显示三对乳腺癌肿瘤组织中VEGF-C均有高水平表达,其中伴有腋淋巴结转移的乳腺癌组织表达量最高,无腋淋巴结转移的乳腺癌组织居次,而化疗后乳腺癌组织表达量相对最低。转移的腋淋巴结组织中VEGF-C表达水平也较正常组织升高。VEGF-C在正常乳腺组织、良性乳腺肿瘤和癌旁组织中表达水平则明显降低。结果提示:VEGF-C的高水平表达往往伴随腋淋巴结的转移,可能与乳腺癌的恶性程度相关,并且经治疗可以明显地下降。我们还检测了多株人乳腺癌细胞株VEGF-C基因的表达,发现其中MDA-MB-435呈高表达,因此我们选用此细胞株用于进一步VEGF-C RNA干扰实验。我们设计合成了3组针对VEGF-C基因的小分子干扰核酸siRNA（smallinterfering RNA）和1组阴性对照序列,通过双酶切连接反应将其插入表达质粒载体pSilencer3.0-H1多克隆位点中的BamHⅠ和HindⅢ酶切位点之间,构建VEGF-C siRNA表达质粒pSifencer3.0-VEGF-C/siRNA1-3,和阴性对照质粒pSilencer3.0-VEGF-C/siRNA4。测序鉴定载体构建成功后,采用脂质体介导的方法转染乳腺癌细胞株MDA-MB-435。Real Time—PCR和Western blot检测转染前后VEGF-C基因和蛋白的表达情况。结果显示,转染3种重组干扰质粒的细胞VEGF-CmRNA相对表达量均小于1,空白对照组和阴性对照组的VEGF-C基因表达无明显变化,我们认为3种siRNA在乳腺癌细胞中均发挥了不同程度的干扰作用。转染24小时后,VEGF-C mRNA水平已开始下降,48小时后下降最明显,而在转染72小时后,VEGF-C mRNA在上述细胞中的表达又稍有回升。其中pSilencer3.0-VEGF-C/siRNA2的干扰效应尤为明显,48小时抑制率达到了85.4%,显示VEGF-C基因表达量有明显降低。转染3种重组干扰质粒的细胞与空白对照组间和阴性对照组比较均有统计学差异,p＜0.0001。Western blot蛋白表达水平分析结果与基因水平相似。我们挑选干扰效率最强的表达载体pSilencer3.0-VEGF-C/siRNA2进行体内外实验研究。在肿瘤细胞体外研究中,我们选用表达载体pSilencer3.0-VEGF-C/siRNA2和阴性对照质粒稳定转染乳腺癌细胞株MDA-MB-435,构建单克隆细胞株。采用RT-PCR方法检测转染细胞的VEGF-C、COX-2和CXCR4基因转录水平的变化;Western blot检测VEGF-C、COX-2和BCl-2蛋白的表达,MTT法和流式细胞仪检测转染细胞的生长情况。结果显示:干扰实验组较阴性对照组,VEGF-C基因和蛋白明显下调。RNA干扰VEGF-C基因表达下调的同时,诱导COX-2、CXCR4基因和COX-2、BCl-2蛋白表达下调。实验组细胞体外生长缓慢,与对照组差异明显p＜0.0001,72小时后凋亡率达60%。VEGF-C RNA干扰显示出对人乳腺癌细胞株MDA-MB-435体外生长抑制和诱导凋亡作用。实验结果提示了VEGF-C基因的部分功能,及其与其它促癌基因间的相互作用。采用原位皮下注射人乳腺癌细胞MDA-MB-435的方法,我们成功建立了Balb/c-nu的裸鼠乳腺癌移植瘤模型,通过质粒肿瘤周围注射的治疗方法,将质粒导入肿瘤细胞。RT-PCR方法检测其下调VEGF-C的基因表达水平,发现同样取得了明显的VEGF-C基因沉默的效果,呈剂量相关。裸鼠体内研究显示,VEGF-C RNA干扰表达质粒治疗能显著抑制乳腺癌裸鼠原位移植瘤的增殖,降低其在裸鼠体内的成瘤性,且呈剂量相关。治疗组肿瘤较对照组生长缓慢,肿瘤体积和重量都较对照组明显降低,高剂量治疗组尤为明显,抑瘤率达88.4%,证实了我们前期的体外细胞实验结果,说明VEGF-C基因沉默的同时抑制了肿瘤的生长。我们采用荧光免疫组化方法,VEGFR-3作为淋巴内皮标记物,粘附分子CD31作为血管内皮标记物,检测了肿瘤组织中微淋巴管和微血管的密度。结果表明治疗组的微淋巴管和微血管密度都显著低于对照组,同时淋巴结CK抗体免疫组化染色发现治疗组无淋巴转移,而对照组淋巴结转移率达60%。证实了VEGF-C RNA干扰表达质粒能显著抑制裸鼠肿瘤组织中微淋巴管的生成、降低肿瘤微淋巴管密度的同时抑制肿瘤淋巴转移。本研究利用RNA干扰技术沉默VEGF-C基因的表达,使我们对于VEGF-C基因促进乳腺癌生长和转移的机制有了新的了解。无论在体外还是在体内,VEGF-C RNA干扰都能显著抑制乳腺癌细胞的增殖、诱导凋亡,能有效地抑制肿瘤淋巴转移。
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标签：血管内皮生长因子论文; 干扰论文; 乳腺癌论文; 基因治疗论文;