利用转基因苜蓿生产轮状病毒可食用疫苗研究

论文题目: 利用转基因苜蓿生产轮状病毒可食用疫苗研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 遗传学

作者: 董江丽

导师: 王涛

关键词: 轮状病毒,衣壳蛋白,转基因植物,可食用疫苗,粘膜免疫

文献来源: 中国农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 增加抗原基因在转基因植株中的表达量是研制安全高效的轮状病毒可食用疫苗的关键,为此,我们对人A组轮状病毒VP6基因进行了密码子优化和全人工合成,合成的基因被命名为“sVP6基因”。分别将病毒来源的VP6基因和sVP6基因连接到原核表达载体pGEX-4T-1中,获得的重组质粒pGVP6和pGsVP6在大肠杆菌BL21细胞中表达的GST-VP6和GST-sVP6融合蛋白大小一致,均为65kDa;SDS-PAGE结果表明,经谷胱苷肽—琼脂糖树脂层析柱纯化、凝血酶酶切、快速蛋白液相色谱系统分离纯化后获得的sVP6蛋白在变性条件下大小为42kDa,在非变性条件下形成三聚体,大小为130kDa,这一特性和未改造的VP6蛋白相同;Western杂交结果证实单体sVP6蛋白和它的三聚体形式都能够和抗VP6的兔抗血清特异性反应,说明密码子改造的sVP6蛋白和未改造的VP6蛋白在结构和免疫反应性上是一致的。 sVP6基因和病毒来源的VP6基因分别以农杆菌介导法转化烟草(Nicotiana tabacum L),Western blot分析结果证实,转基因烟草植株表达了sVP6蛋白和VP6蛋白。在sVP6基因转化的烟草叶片中,sVP6蛋白的最高含量达到植物总可溶性蛋白的0.34%,密码子优化使得抗原蛋白的表达量提高了3.8—34倍。 在用模式植物烟草建立了高效表达抗原蛋白的平台的基础上,我们以农杆菌介导法将sVP6基因整合到紫花苜蓿(Medicago sativa L)的基因组中,在转基因苜蓿叶片中,sVP6蛋白的最高含量达到植物总可溶性蛋白的0.28%。 用10mg转基因苜蓿总可溶性蛋白(含有24μg sVP6蛋白)辅以10μg CpG免疫佐剂灌胃免疫6—8周龄的BALB/c母鼠4次,母鼠体内产生了高水平的抗VP6的血清IgG和粘膜IgA抗体。用猿轮状病毒SA-11对免疫后母鼠所生育的乳鼠攻毒,结果表明,与对照组相比,转基因苜蓿免疫的母鼠所生育的乳鼠的腹泻症状明显减轻,腹泻持续时间明显缩短,腹泻比率明显降低,在攻毒后第五天,所有的乳鼠不再腹泻。这些研究结果表明转基因苜蓿表达的轮状病毒VP6抗原免疫母鼠所产生的特异性抗体能够诱导乳鼠产生被动免疫,并为乳鼠提供异源交叉保护。本项研究为利用紫花苜蓿作为生物反应器生产轮状病毒可食用疫苗保护儿童和幼畜免受病毒性腹泻的侵染奠定了基础。

论文目录:

摘要

Abstract

缩略词

第一章 文献综述

1 植物生物反应器生产可食用疫苗研究进展

1.1 可食用疫苗的表达系统

1.2 可食用疫苗的可行性

1.3 植物生物反应器表达的抗原及其对实验动物的免疫研究进展

1.4 可食用疫苗的人体临床免疫研究进展

1.5 增强免疫保护、避免免疫耐受的策略分析

1.6 问题与展望

2 轮状病毒疫苗研究进展

2.1 轮状病毒的结构

2.2 轮状病毒的致病机制

2.3 轮状病毒疫苗研究现状

2.4 轮状病毒疫苗免疫途径

2.5 问题与展望

3.本论文研究的目的意义

第二章 轮状病毒VP6基因的改造及在大肠杆菌中的表达

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 sVP6基因的合成

2.2 原核表达载体pcVP6、pGsVP6的构建

2.3 VP6和sVP6蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化

2.4 用GST-VP6融合蛋白免疫家兔制备抗体

第三章 VP6基因和改造的sVP6基因在转基因烟草中的表达

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 植物转化载体的构建

2.2 植物表达载体转化根癌农杆菌LBA4404

2.3 转基因烟草植株的获得

2.4 转基因烟草的分子检测

2.5 转基因烟草的Western杂交分析

2.6 转基因烟草的定量ELISA分析

第四章 转基因苜蓿表达的轮状病毒疫苗的免疫学研究

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 农杆菌介导的苜蓿遗传转化

2.2 转基因苜蓿的PCR鉴定

2.3 转基因苜蓿的PCR-Southern杂交分析

2.4 转基因苜蓿的RT-PCR鉴定

2.5 转基因苜蓿的Western杂交分析

2.6 转基因苜蓿的定量ELISA分析

2.7 转基因苜蓿的拷贝数分析

2.8 PCR扩增检测无性扩繁的转基因苜蓿植株

2.9 转基因苜蓿免疫的小鼠产生的抗体滴度测定76

2.10 Western杂交检测植物疫苗免疫小鼠后产生的抗体的特异性

2.11 乳鼠攻毒实验

第五章 讨论与结论

1 讨论

1.1 选择VP6蛋白研制轮状病毒疫苗的可行性

1.2 转基因植物疫苗与粘膜免疫

1.3 紫花苜蓿高效表达轮状病毒疫苗

1.4 CpG ODN作为粘膜免疫佐剂的可行性

1.5 轮状病毒VP6蛋白诱导被动免疫

1.6 可食用疫苗发展前景

2 结论

参考文献

致谢

作者简介

发布时间: 2005-07-18

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