论文摘要
自1988年Payne L等发现ALV-J以来,几乎在全世界的白羽肉鸡群中发现了此病。近十年来,蛋鸡品系中也出现ALV-J的感染,且地方品系鸡中ALV-J的感染也频见报道。而且,ALV-J发病出现了新的特点,一:发病日龄提前,感染范围增大;二:发病形式更是多种多样,同时出现了多种病毒的混合感染的现象,给防治带来的新的难题;三:血管瘤型ALV-J的出现,除导致髓细胞瘤的发生外,病鸡在外表皮肤、关节、毛囊或内脏等出现血泡或血洞,病鸡常因大量失血而死亡。为了解山东地区蛋鸡禽白血病（Avian Leukosis, AL）流行情况,从泰安、临沂、青岛、聊城等4个地区的祖代种鸡及其相应的父母代、商品代鸡场无菌采集1 827份血清（祖代鸡血清597份、父母代鸡血清710份、商品代鸡血清520份）和1 209份泄殖腔棉拭子（祖代鸡棉拭子597份、父母代鸡棉拭子460份、商品代鸡棉拭子152份）。通过ELISA试剂盒进行了ALV-J、ALV-AB抗体检测及P27抗原检测。检测结果显示,山东地区祖代种鸡未检测到ALV-J抗体,ALV-AB抗体检出率极低,仅为0.84%,但个别祖代鸡场P27抗原的阳性率较高,可能主要与不规范杂交扩繁导致内源性病毒感染有关,也不能排除免疫耐受感染因素;父母代种鸡ALV-J抗体水平均较高,明显高于ALV-AB抗体阳性水平,P27抗原的阳性率也有所升高;商品蛋鸡ALV-J及ALV-AB抗体水平明显高于父母代水平,但P27抗原阳性率未见明显增加。在上述某商品代蛋鸡场采血时发现疑似血管瘤型病鸡,并且在其父母代及祖代鸡群中也发现疑似ALV病鸡。通过PCR、IFA及ELISA检测方法,从该具有血缘关系的祖代、父母代及商品代鸡中分离到共6株ALV-J,其中祖代、父母代中各分离到1株病毒,分别命名为SDDP1001株和SDDP1002株;商品代蛋鸡中分离到4株病毒,分别命名为SDDP1003株、SDDP1004株、SDDP1005株、SDDP1006株,在国内尚属首次。根据ALV-J原型毒株HPRS103设计一对特异性引物,扩增gp85基因,并与各亚群参考毒株序列核苷酸进行同源性分析,结果显示:分离自商品代蛋鸡的SDDP1003株、SDDP1004株、SDDP1006株和父母代分离株SDDP1002位于同一分支,同源性在97.2%-97.9%之间,与HPRS103株同源性94.7%-95.2%;SDDP1005与祖代分离株SDDP1001株在同一分支,与HPRS103株同源性为98.3%,4株分离自商品代的ALV-J同源性为95.0%-99.9%;6株病毒与A亚群代表株RAV-1A和B亚群代表株RAV-2 B的同源性仅在12.0%-12.8%之间,与E亚群代表株ev-1 E同源性为12.2%-12.4%之间。选取三株代表病毒（SDDP1001株、SDDP1002株和SDDP1006株）进行病毒的毒价及复制动力学特性分析,结果表明:分离自祖代的病毒株滴度最高,为105.59TCID50/0.1ml,而父母代SDDP1002株和商品代SDDP1006株病毒滴度相近,分别为104.61TCID50/0.1ml和104.71TCID50/0.1ml,三株病毒具有相似的复制动力学曲线。等量三株病毒分别感染DF-1细胞,检测结果表明,等量病毒感染细胞后在相同时间内祖代SDDP1001株病毒上清中含有更高的感染性病毒。病毒分离结合ELISA（或者IFA）的检测方法是ALV-J感染的“金标准”,但是费时费力,而且ELSIA检测试剂盒价格昂贵,不适用于鸡场进行大规模检测。此外,由于ALV-J感染细胞后不产生细胞病变,不能通过组织半数感染量对病毒进行定量。因此,为了更好进行临床样品的检测和实验室研究,需要建立一种快捷、简便、灵敏,并且能够的定量的ALV-J检测方法。本研究中针对pol基因和env基因结合处保守区域设计了一对特异性引物和一条探针,建立了TaqMan实时荧光定量PCR方法,通过对荧光定量PCR的反应体系和反应条件的摸索优化,使得其在101～1010copy/μl具有良好的线性关系。同时进行了重复性、特异性、敏感性试验,结果表明该方法重复性好,敏感性高,可检测初始模板中10个拷贝的病毒核酸,且不与其他禽病病毒发生非特异性反应。该方法的建立为ALV-J的早期快速诊断提供了一种简便、灵敏、快捷的检测方法。
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标签：病原学与血清学调查论文; 血管瘤论文; 分离鉴定论文; 荧光定量论文;