let-7c对肝癌细胞增殖的影响及其机制

论文摘要

背景和目的MicroRNA （miRNA）是一种约22个核苷酸长度的小分子单链RNA。在肿瘤中,与周围正常组织相比,一些miRNA发生异常表达。研究发现这些异常表达的miRNA能影响肿瘤的增殖、分化、凋亡、侵袭等生物学行为。let-7家族最早被发现在肺癌细胞中表达下降,能通过调控靶基因RAS等来抑制肺癌细胞的增殖。但let-7对肝癌细胞的作用有待研究,而且其新的靶点尚需揭示。本研究着力于探讨人源性let-7c （hsa-let-7c）对人肝癌细胞增殖的影响,并揭示其新的靶基因。方法选取人肝癌细胞系HCCLM3,用lipofectamine 2000脂质体做为载体将miRNA转染入细胞。研究设三组,let-7c组为转染了let-7c的癌细胞,对照组为转染了阴性对照miRNA的癌细胞,空白组为未转染任何试剂的癌细胞。CCK-8法检测各组细胞增殖生长情况；用流式细胞术检测各组细胞周期的分布差异；利用生物信息学网站查找出let-7c的潜在靶基因cyclin D1、cyclin D2、CDK6; western blot验证各组细胞cyclin D1、cyclin D2、CDK6蛋白的表达差异；实时荧光PCR验证各组cyclin D1、CDK6 mRNA的表达差异；构建含cyclin D1、CDK6的3’UTR的荧光素酶报告基因验证let-7c对3’UTR的直接结合作用。结果1.CCK-8法检测各组HCCLM3细胞转染24h、48h、72h、96h的吸光度。结果发现24h时,各组细胞吸光度无差异（P>0.05）,而48h、72h、96h各时间点let-7c组吸光度均低于空白组与对照组（P值均<0.05）,空白组与对照组在三个时间点吸光度值均无差异（P值均>0.05）。2.流式细胞术检测转染后72h各组细胞周期的分布情况,结果let-7c组细胞分布在G1期的细胞百分比为54.52%±0.13%,空白组的比例为43.53%±0.86%,对照组为44.82%±0.77%。let-7c组的G1期细胞比例高于空白组与对照组,差异明显（P值均<0.01）,而空白组与对照组没有差异（P>0.05）。3.查找Target Scan、PicTar等生物学预测网站,预测let-7c新的靶基因cyclin D1、cyclin D2、CDK6。4. Western blot检测结果显示,let-7c组cyclin D1、cyclin D2、CDK6在转染48h后均低于对照组与空白组,而空白组与对照组比较无差异。5.实时荧光PCR显示转染了let-7c的细胞中,cyclin D1的mRNA在转染后24h时发生了下降,CDK6的mRNA在转染后48h发生下降,与空白组和对照组均有差异（P值均<0.05）。而空白组与对照组相比各mRNA表达没有差异（P值均>0.05）。6.双荧光素酶报告基因结果显示,与对照miRNA相比,let-7c能抑制含有cylin D1、CDK63’UTR的荧光素酶报告基因的活性（P值均<0.05）。结论1.1et-7c能抑制人肝癌细胞HCCLM3的增殖,并使细胞处于G1期的比例增加。2.1et-7c能抑制G1期重要调控子cyclin D1、cyclin D2、CDK6的蛋白及mRNA表达,这是导致G1期细胞比例增加的潜在原因。3.荧光素酶报告基因实验证实cyclin D1、CDK6是let-7c的靶基因,let-7c能结合它们的3’UTR。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 let-7c对HCCLM3细胞增殖的影响
• 材料与方法
• 结果
• 小结
• 第二部分 应用生物信息学手段预测let-7c的靶基因
• 方法
• 结果
• 小结
• 第三部分 let-7c调控cyclin D1、cyclin D2以及CDK6的表达
• 材料与方法
• 结果
• 小结
• 全文讨论
• 参考文献
• 综述
• 附件
• 致谢