长江华溪蟹和无齿隐匿相手蟹转录组的比较分析

论文摘要

短尾类包含超过6,793种已知物种,其中约32%栖居于淡水（Ng et al.,2008, Samuel et al.,2011）.淡水蟹类经历了长期的淡水生活,在生殖、个体发育和机体盐水平衡的调节等方面已发生很大的适应性变化。然而蟹类基因组学研究数据的匮乏限制了对淡水蟹类适应进化的研究。转录组作为基因组中所有蛋白编码基因的总和,可以为推断生物的适应进化提供重要的线索和依据。基于高通量测序技术的转录组测序为我们在目前条件下研究淡水蟹类的适应进化提供了一个快捷、可行的途径。长江华溪蟹（Sinopotamon ynngtse kiense）属真淡水蟹类,是我国特有的华溪蟹属的代表。无齿隐匿相手蟹（Sesarma neglectum）分布于东亚沿海,常见于河口咸淡水环境中。本论文以长江华溪蟹和无齿隐匿相手蟹为研究对象,通过对两种蟹类转录组的测序和比较研究,以期在转录组水平对蟹类的淡水适应进化进行探讨。本文对两种蟹类的转录组测序结果,分别获得59,084,458和62,386,654条原始读段。在筛除低质量的序列后,利用Trinity软件对序列进行了组装和拼接,分别得到了95,148和102,019条基因序列。用Blast软件将基因序列在多个数据库中进行了比对,超过30%的基因获得了功能注释。通过GO和COG注释对基因的功能进行了分类。此外,在两种蟹类的转录组序列中还分别检测到大量的SSR候选标记,极大的丰富了在核基因水平开展种群进化研究的分子遗传信息。在两种蟹类的转录组中共鉴别出4,930对直系同源基因,通过选择压力分析,发现9对同源基因Ka/Ks的比值大于0.5,其中2对基因的Ka/Ks比值大于1。通过RPKM法对两个转录组进行差异表达基因分析,筛选出了121,218条差异表达的基因,对这些基因进行了GO功能富集分析和KEGG代谢通路富集分析。将筛选获得的差异表达基因与本实验室测序获得的中华绒螯蟹不同发育阶段的数字基因表达谱（DGE）数据进一步比较,基于基因序列同源性和功能注释筛选获得了5条可能与两种蟹类机体渗透压调节或高渗应激相关的差异表达基因,包括是V家族ATP酶、碳酸酐酶、热休克蛋白70、热休克蛋白90和电压依赖性阴离子通道基因。通过对不同盐度条件驯养的两种蟹类鳃组织的半定量RT-PCR检验,发现HSP70和HSP90在两种蟹类中产生与盐度应激相应的表达变化；其余三条离子通道基因在两种蟹类中的表达也随着盐度条件的变化而发生相应变化,提示它们很可能在淡水蟹类的渗透压调节中具有一定的作用。该结果为今后通过实时定量PCR对这些基因的表达进行深入研究提供了重要参考。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 溪蟹对内陆淡水环境的适应进化
• 1.2 转录组研究的方法
• 1.3 无参考基因组（De Novo）的转录组测序
• 第二章 长江华溪蟹转录组高通量测序与数据分析
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验器具的准备
• 2.2.2 实验材料与RNA提取
• 2.2.3 cDNA文库的构建和测序
• 2.2.4 转录组数据的De Novo拼接
• 2.2.5 基因注释
• 2.2.6 蛋白质编码区的提取
• 2.2.7 表达量的计算
• 2.2.8 GO和COG功能分类
• 2.2.9 KEGG代谢途径分析
• 2.2.10 微卫星的查找
• 2.3 结果
• 2.3.1 转录组测序结果与组装
• 2.3.2 基因注释
• 2.3.3 GO和COG功能分类
• 2.3.4 KEGG代谢通路分析
• 2.3.5 微卫星标记的查找
• 2.4 讨论
• 第三章 无齿隐匿相手蟹转录组高通量测序及数据分析
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验材料与方法
• 3.3 结果
• 3.3.1 转录组测序结果与组装
• 3.3.2 基因注释
• 3.3.3 GO和COG功能分类
• 3.3.4 KEGG代谢通路分析
• 3.3.5 微卫星的查找
• 3.4 讨论
• 第四章 长江华溪蟹和无齿隐匿相手蟹转录组比较分析
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 直系同源基因的鉴别
• 4.2.2 基因的选择压力分析
• 4.2.3 目标基因在两种蟹类鳃组织中的表达分析
• 4.3 结果
• 4.3.1 长江华溪蟹与无齿隐匿相手蟹转录组GO分类比较
• 4.3.2 直系同源基因的鉴别
• 4.3.3 基因的选择压力分析以及检测正选择位点
• 4.3.4 差异表达基因的GO分类及KEGG代谢通路分析
• 4.3.5 目标基因在两种蟹类鳃组织中的表达分析
• 4.4 讨论
• 下一步的研究展望
• 参考文献
• 在读期间发表的学术论文及研究成果
• 致谢