论文摘要
目的构建重组质粒pGEX-6p-2/Foxp3,并转化至表达宿主菌E.coli BL21（DE3）中诱导表达,以纯化蛋白为抗原免疫新西兰兔制备抗小鼠Foxp3的多克隆抗体,对抗体进行滴度及特异性的分析。以制备的抗体为一抗Western-blot检测小鼠1型糖尿病模型脾细胞中Foxp3的表达情况,为进一步研究Foxp3奠定了基础。方法（1）小鼠Foxp3重组蛋白的表达、纯化和多抗制备软件分析小鼠Foxp3基因,选取第532～1008bp位碱基序列为目的基因,其编码产物159aa具有强抗原性及高特异性。以pMIGR1/ Foxp3重组质粒为模板,PCR扩增目的片断,将目的片断克隆至原核表达载体pGEX-6p-2,构建重组质粒pGEX-6p-2/Foxp3,经酶切、PCR及测序鉴定后转化至表达宿主菌E.coli BL21（DE3）中诱导表达,SDS-PAGE和Western-Blot鉴定表达产物;对重组融合蛋白（目的蛋白和GST蛋白）进行大量诱导表达,用GST琼脂糖凝胶FF纯化柱纯化,SDS-PAGE和Western-Blot分析和鉴定纯化蛋白,采用BCA试剂盒测定纯化蛋白浓度;用纯化的重组融合蛋白免疫新西兰兔,制备抗血清;采用ELISA法测定抗血清效价;利用脂质体法分别转染pMIGR1/Foxp3及pMIGR1入NIH3T3细胞,提取转染细胞的总蛋白,以制备的多抗为一抗进行Western-blot法检测NIH3T3转染细胞表达的Foxp3,对制备的多抗进行特异性分析。（2） Foxp3在小鼠1型糖尿病模型中的表达研究用STZ诱导小鼠1型糖尿病模型,严密观察饮食情况,定期称体重,测量尿糖及血糖变化,制作胰腺、胃黏膜及甲状腺组织的病理切片以观察其病理改变;流式细胞术检测脾细胞中CD4+T细胞和CD4+CD25+T细胞数量的变化;RT-PCR、半定量Western-blot分别在mRNA、蛋白水平检测小鼠脾细胞中Foxp3的表达。结果PCR扩增得到长477bp的目的片断;构建的重组质粒pGEX-6p-2/Foxp3经酶切、PCR和测序鉴定证明其中插入片段为目的基因;含pGEX-6p-2/Foxp3重组菌经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳结果显示,得到一分子量约45kDa的重组融合蛋白GST-Foxp3,用GST琼脂糖凝胶FF纯化柱对重组融合蛋白进行纯化;Western-blot鉴定诱导表达的蛋白及纯化蛋白能被抗GST单抗识别,在45kDa附近有特异条带,与预期融合蛋白大小一致;以纯化的Foxp3重组融合蛋白为抗原免疫新西兰兔制备抗Foxp3抗体,ELISA法检测所得抗体效价在1∶1 2 800以上,Western-blot结果显示:转染pMIGR1/Foxp3的NIH3T3细胞总蛋白能被抗小鼠Foxp3多抗特异性识别,而转染pMIGR1的NIH3T3细胞总蛋白未出现任何条带;STZ诱导的小鼠1型糖尿病模型组与正常组及对照组相比,有明显的多饮、多食、多尿和体重减轻等典型的糖尿病表现;模型鼠在造模1月后出现不同程度的尿糖改变,血糖水平也显著升高,胰岛有不同程度的胰岛炎性改变,而其它两组尿糖均阴性,血糖水平正常,胰岛未发生病理改变;流式分析T淋巴细胞亚群在小鼠脾细胞中的比例在各组之间变化明显,用STZ致诱小鼠糖尿病后,CD4+T细胞显著升高,而CD4+CD25+T细胞在模型组小鼠脾细胞中的比例也较正常组及对照组稍有升高,但是模型组CD4+CD25+T与CD4+T细胞的比值较正常组及对照组显著偏低;RT-PCR检测小鼠脾细胞中Foxp3 mRNA的表达水平,模型组小鼠的脾细胞中Foxp3 mRNA的表达与内参（G3PDH）的比稍高于正常组及对照组;半定量Western-blot结果显示模型组的脾细胞中Foxp3在蛋白水平的表达量亦稍高于正常组及对照组。结论（1）成功构建了pGEX-6p-2/Foxp3原核表达载体,其在大肠杆菌BL21（DE3）中表达出一分子量约为45kDa的重组融合蛋白;（2）诱导表达的重组融合蛋白具有较好的免疫原性,能刺激新西兰兔产生高效价的特异性抗体;（3）小鼠1型糖尿病模型中Foxp3的表达量稍升高,仍不能使CD4+CD25+Treg与CD4+T细胞的比值保持平衡而来抑制效应性CD4+T细胞的增殖。