论文摘要
慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemian，CML）是一种起源于异常多能造血干细胞的克隆增殖性疾病，其特征性的BCR/ABL融合蛋白具有强烈酪氨酸激酶活性，能够激活PI3K（Phosphatidylinositol-3kinase）、Ras（Renin-angiotensin system）、STAT5（Signal transducer andactivator of transcription5）等信号转导通路，从而导致细胞恶性转化。其中，Bcr-Abl融合蛋白第177位酪氨酸磷酸化后（Y177-p），能与Grb2的SH2结构域特异性结合，再通过激活RAS-MAPK和PI3K-AKT信号转导通路，导致细胞恶性转化。在细胞凋亡信号通路中，凋亡蛋白Caspase8的激活是细胞发生凋亡的关键一步。在SH2结构域可与Bcr-Abl的Y177-p特异性结合，以及Caspase8蛋白能诱导凋亡的分子基础上，本研究拟构建携带SH2-Casp8融合肽的重组腺病毒Ad5F35-SH2-Casp8（简称Ad5F35-SC），在课题组前期已在体外实验中证明了其具有促进CML细胞凋亡和抑制增殖作用的基础上，进一步探讨Ad5F35-SC对慢性粒细胞白血病模型小鼠的体内效应。本研究主要实验方法、结果及结论如下：1重组腺病毒Ad5F35-SC及其突变体的构建与鉴定PCR扩增SC和SmC基因，分别克隆至pAdTrack-CMV构建穿梭质粒。穿梭载体经PmeI酶切，转化pAd5F35-BJ5183感受态，细菌内同源重组产生复制缺陷型重组腺病毒载体pAd5F35-SC及其突变体，经PacI酶切后将其转染AD293细胞进行包装，获得重组腺病毒Ad5F35-SC，经PCR和western blot鉴定后，扩增病毒并测定滴度。鉴定结果证明重组腺病毒载体pAd5F35-SC和pAd5F35-SmC构建成功；EGFP表达检测，PCR和western blot结果表明重组腺病毒Ad5F35-SC包装和扩增成功，滴度为1.6×1012。2Ad5F35-SC对白血病K562细胞裸鼠皮下实体瘤模型的治疗作用构建白血病皮下实体瘤模型，皮下多点注射重组腺病毒Ad5F35-SC后，观察瘤体体积的变化、HE染色的病理变化、透射电镜和TUNEL实验原位检测细胞凋亡。与未经治疗的K562细胞成瘤组相比，经Ad5F35-SC治疗的皮下瘤体积增长速度明显减慢，肿瘤体积较小；病理组织切片表现出胞核浓缩、细胞染色加深等凋亡改变；TUNEL原位凋亡检测显示凋亡细胞比例明显增高。透射电镜观察到肿瘤细胞发生线粒体轻微肿胀和产生凋亡小体等凋亡现象。Ad5F35-SC预处理K562细胞经后构建裸鼠皮下瘤，观察瘤体生长情况。结果证实：重组腺病毒Ad5F35-SC并能够抑制K562细胞在裸鼠体内的致瘤能力并能抑制K562细胞裸鼠皮下实体瘤增长、促进瘤体细胞发生凋亡。3重组腺病毒Ad5F35-SC对BP210细胞移植瘤模型小鼠致瘤能力的影响分别将BP210（BCR-ABL转化细胞株）细胞和Ad5F35-SC预处理的BP210细胞通过尾静脉注射Balb/c小鼠，构建白血病成瘤组模型和预处理组模型，同时将未经任何处理的Balb/c小鼠设为正常对照组。观察细胞移植后小鼠的生长状况、体重、外周血白细胞计数、外周血和骨髓涂片瑞氏染色细胞形态学；处死小鼠后手术分离各脏器，观察各组小鼠脏器是否有肿大、出血等变化，并做组织切片HE染色观察组织的病理变化。最后制作小鼠的生存曲线判断小鼠的生存率变化。成瘤组小鼠在第4周左右开始出现、体重进行性下降、外周血白细胞计数进行性升高、双后肢拖行等表现；外周血、骨髓涂片染色发现白血病细胞增多；解剖发现脾脏明显增大，病理组织学检查发现肝脾均有大量的白血病细胞浸润。而Ad5F35-SC预处理组小鼠仅在注射后第56周开始部分小鼠出现类白血病症状；肝脏、脾脏未见明显增大，肝、脾病理组织学检查仅见轻微的白血病细胞浸润。通过生存曲线观察到预处理组小鼠的生存期比成瘤组明显延长。以上结果证实：BP210细胞经过Ad5F35-SC预处理后可以明显降低其在小鼠体内致白血病的潜能并延长CML小鼠生存期。
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相关论文文献
- [1].人结肠癌动物皮下实体瘤模型的建立[J]. 中山大学学报(医学科学版) 2012(02)
- [2].ABL SH3-T79Y突变体联合伊马替尼对慢性粒细胞白血病细胞增殖的影响[J]. 解放军医学杂志 2015(08)
标签：慢性粒细胞白血病论文; 蛋白论文; 重组腺病毒论文; 动物模型论文;