苏云金芽胞杆菌4.0718新菌株功能基因组的研究和高效杀虫工程菌的构建

论文摘要

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）4.0718菌株是新筛选的一株高毒力菌株,现已成功用于商业化生产。该菌株在芽胞形成的同时能够产生菱形和方形两种晶体,对棉铃虫（Helicoverpa armigera）等农业害虫表现出高效杀虫活性。为了全面阐述该菌株高效杀虫的背景,更好地利用该菌株进行生物杀虫剂的开发,本研究系统分析了Bt 4.0718菌株的杀虫基因型及表型,包括质粒带型、杀虫基因类型和晶体蛋白类型的研究。结果显示,Bt 4.0718菌株在质粒带型和蛋白带型上是一个独特的Bt新菌株。PCR检测发现该菌株含有5种cry基因,包括cry1Aa、cry1Ac、cry2Aa、cry2Ab和cry1Ia基因,同时含有vip3A和几丁质酶基因。采用SDS-PAGE和液质联用质谱仪（LC-MS/MS）分析Bt 4.0718菌株的晶体蛋白,鉴定到该菌株的130 kD蛋白由Cry1Aa和Cry1Ac原毒素组成,而65 kD的蛋白由Cry2Aa原毒素组成。为了更快地筛选具有新的杀虫特性的Bt菌株或杀虫晶体蛋白,本研究创新性地建立了一种对Bt原毒素表达谱进行鉴定的新方法,即通过包埋Bt菌株产生的晶体蛋白混合物于聚丙烯酰胺凝胶块中,结合LC-MS/MS分析胶内酶解的复合肽段,从而快速鉴定晶体蛋白中原毒素的组成。本研究首先以模式菌株Bt库斯塔克亚种（Bt subsp.kurstaki）HD1菌株为对象,采用该方法检测HD1菌株晶体蛋白的组成。结果显示,采用聚丙烯酰胺凝胶块结合LC-MS/MS技术能准确检测到HD1菌株中表达的Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac和Cry2Aa蛋白。同时,本研究以杀虫基因背景很清楚的Bt以色列亚种（Bt subsp.israelensis）4Q2-72和鲇泽亚种（Bt subsp.aizawa）HD133菌株为研究对象,检测到4Q2-72菌株表达了Cry4Aa、Cry4Ba、Cry10Aa、Cry11Aa、cyt1Aa和Cyt2Ba等6种晶体蛋白,而HD133也表达了Cry1Ab、Cry1Cb、Cry1Da、Cry1Ba、Cry1Ad和Cry1Ka 6种原毒素,其中后两种原毒素还未在任何文献中见报道。这些实验结果证实了该种原毒素检测方法是一种新型的鉴定Bt原毒素表达谱的方法,具有直接、快速、准确的特点。该方法将有力推动Bt菌株的筛选工作,对于其它生物组织的蛋白质组学分析也具有重要的参考价值。为了获得毒力更高和杀虫谱更广的Bt菌株,扩展Bt杀虫剂在农林害虫防治上的应用,本研究采用分子生物学手段将Bt cry1Ac基因与来源于虎纹捕鸟蛛的具有蛋白酶抑制剂活性的基因hwtx-11融合,构建了系列工程菌,并成功地在大肠杆菌和Bt无晶体突变株中检测到了Hwtx-11和融合蛋白Cry1Ac-Hwtx-11的表达。通过检测工程菌发酵产物对甜菜夜蛾和棉铃虫初孵幼虫的生物活性,发现Hwtx-11对甜菜夜蛾有明显毒力,且明显减慢了甜菜夜蛾的生长速度,融合蛋白Cry1Ac-Hwtx-11对两种靶标昆虫表现出比Cry1Ac蛋白更高的杀虫毒力。本研究为构建具有不同杀虫特性的融合蛋白以及构建高毒力的工程菌株奠定了重要基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 苏云金芽胞杆菌研究进展
• 1.1 Bt杀虫晶体蛋白基因
• 1.1.1 Bt杀虫晶体蛋白基因的分类
• 1.1.2 Bt杀虫晶体蛋白基因的表达调控
• 1.2 Bt杀虫晶体蛋白的结构及功能
• 1.2.1 Bt杀虫晶体蛋白的结构
• 1.2.2 晶体蛋白的作用机理
• 1.2.3 晶体蛋白结构与功能的关系
• 1.3 Bt基因组学研究
• 1.4 Bt伴胞晶体的蛋白质组学研究
• 1.5 Bt工程菌的研究进展
• 1.6 立题依据和目的意义
• 第二章 苏云金芽胞杆菌4.0718新菌株功能基因组的研究
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 研究方法
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 Bt 4.0718菌株质粒DNA的图谱
• 2.3.2 Bt 4.0718菌株内cry基因的检测
• 2.3.3 Bt 4.0718菌株伴胞晶体的形态观察
• 2.3.4 Bt 4.0718菌株杀虫晶体蛋白的SDS-PAGE分析
• 2.3.5 Bt 4.0718菌株杀虫晶体蛋白的质谱分析
• 2.3.6 室内生物测定
• 2.4 讨论
• 第三章 苏云金芽胞杆菌原毒素分子鉴定新技术的研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 研究方法
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 Bt HD1和4Q2-72菌株杀虫晶体蛋白的SDS-PAGE分析
• 3.3.2 Bt HD1菌株晶体蛋白中原毒素组成的鉴定
• 3.3.3 Bt以色列亚种402-72菌株晶体蛋白中原毒素组成的鉴定
• 3.4 讨论
• 第四章 苏云金芽胞杆菌工程菌的构建与功能分析
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料
• 4.2.2 方法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 cry1Ac-hwtx-11融合基因的构建
• 4.3.2 hwtx-11在BL21（DE3）中的克隆表达
• -B中的表达'>4.3.3 cry1Ac-hwtx-11融合基因在Bt Cry^-B中的表达
• 4.4 讨论
• 第五章 主要研究结论与进一步研究设想
• 5.1 主要研究结论
• 5.2 进一步研究设想
• 参考文献
• 论文发表情况
• 致谢