论文摘要
研究背景鼻咽癌（]nasopharyngeal carcinoma, NPC）是我国南方高发的一种鼻咽部恶性上皮性肿瘤,由于鼻咽部位置隐蔽,患者早中期常无明显不适症状,所以临床早期诊断、可治疗比例较低,确诊的病例中70%已为中晚期,常伴有转移,失去了最佳治疗时期。临床上治疗主要采取放疗为主,手术及化疗为辅的方式进行治疗,化疗一般采取以铂类化疗药为主的联合放化疗方案,虽然近几十年,随着整体医疗水平的提高,对鼻咽癌的早期诊断和治疗手段有明显提高,但五年生存率仅徘徊在50%-60%之间。复发和转移导致预后不良。因此,目前急切地需要寻找一种新的并且有效的方法来治疗鼻咽癌。肿瘤干细胞（cancer stem cells, CSCs）研究是近年来生物学和医学领域的的一个研究热点,肿瘤干细胞的理念用于解释肿瘤细胞的异质性已经很久了,随着对肿瘤干细胞研究的进一步深入,发现肿瘤干细胞是肿瘤形成和耐药的根本原因。肿瘤干细胞具有自我更新、无限增殖、分化、高致瘤性等特性,并且在肿瘤生成、复发、转移和耐药等过程中发挥重要的作用。鼻咽癌干细胞的研究是目前鼻咽癌研究领域的特点,而且越来越多的研究表明在鼻咽癌中存在肿瘤干细胞,并且发现肿瘤干细胞是鼻咽癌发生发展、复发转移的基础。因此,寻找一种能够抑制或杀灭鼻咽癌肿瘤干细胞的有效手段对成功治疗鼻咽癌至关重要。因为肿瘤干细胞在肿瘤细胞中占的比例极少,而且体外培养时,肿瘤干细胞迅速分裂增殖,不易进行体外扩增,因此体外大规模地培养肿瘤干细胞用于抗肿瘤干细胞药物的筛选还未能实现。如何在体外获得稳定、富含肿瘤干细胞的细胞亚群是体外筛选抗肿瘤干细胞药物的关键技术之一,也是我们首先要做的。目前肿瘤干细胞体外分离的常用方法有细胞表面分子标志物分选法（一些细胞表面蛋白如CD44、CD133和胚胎干细胞标记物已经广泛应用于鉴定肿瘤干细胞）、侧群细胞分选法（依赖ABCG2分子能将核特异性染料Hoechst 33342泵出细胞外,流式细胞仪检测Hoechst染料阴性或弱阳性的为SP细胞这个原理,目前已有实验证明SP细胞可应用于鉴别和分选鼻咽癌肿瘤干细胞）、无血清悬浮培养法（含EGF、bFGF、B27等生长因子的无血清培养基可以使肿瘤干细胞在此条件下悬浮生长和体外扩增而不发生分化,因此通过无血清培养基培养形成肿瘤细胞球可以用来富集肿瘤干细胞）、上皮间充质细胞转化、PKH26标记（一种亲脂性的红色荧光染料,可与细胞膜的脂质双分子层不可逆结合,而肿瘤干细胞具有生长周期长,常处于相对静止状态,目前已有报道PKH26可标记静止期细胞,PKH26阳性细胞具有肿瘤干细胞性质,因此PKH26标记可作为肿瘤干细胞标记）、 乙醛脱氢酶（乙醛脱氢酶催化乙醛氧化成羧酸,是一系列氧化各种脂肪族醛、芳香族醛为相应酸的酶,在生物体内外的代谢中扮演着重要角色,ALDHlhigh是乳腺癌、肺癌、头颈部肿瘤、胰腺癌、宫颈癌、前列腺癌、肝癌、肠癌和膀胱癌肿瘤干细胞的分子标记）等。当前的观点认为常规化疗药物只能杀伤占肿瘤绝大部分的非肿瘤干细胞,而不能有效地杀伤肿瘤干细胞。化疗药物因为其没有选择性、特异性,导致化疗药物在临床使用时常常伴随很大的副作用。因此,对肿瘤干细胞的深入研究,可以确认特异性针对肿瘤干细胞的药物,对于临床上治疗肿瘤很关键。桑叶是桑科桑属植物桑（Morus alba L.）的叶子,性寒,味甘苦,具有疏散风热、清肺润燥、清肝明目之功效,是常用中药之一,在全国各地有广泛的种植。现代药理研究证明,桑叶除了具有降血糖、清除自由基、抗菌、抗病毒等药理作用外,还具有抗肿瘤活性。主要报道了黄酮类、生物碱类等若干化合物单体,对增殖肿瘤细胞具有抑制作用,动物在体评价较少,以肿瘤干细胞为靶点的活性成分研究尚未见相关报道。本论文旨在研究桑叶提取物（SangA）对鼻咽癌细胞增殖、侵袭和转移的影响,并在干细胞水平研究SangA对鼻咽癌肿瘤干细胞活性的影响。本研究以常规化疗药物顺铂作为阳性对照、水作为空白对照和DMSO作为溶剂对照,通过MTT、平板克隆、transwell侵袭、transwell迁移研究了桑叶提取物A（SangA）对鼻咽癌细胞增殖、侵袭和转移的作用；通过侧群分析、肿瘤球形成及裸鼠体内成瘤等相关实验研究了桑叶提取物A （SangA）和对鼻咽癌肿瘤干细胞的作用。证明了桑叶提取物A（SangA）可以有效地抑制鼻咽癌细胞的增殖、侵袭和转移,以及有效地抑制鼻咽癌肿瘤干细胞。研究目的1.检测SangA抑制鼻咽癌细胞增殖、侵袭及转移的作用2.从细胞和整体动物两个层面全面评价SangA的抗鼻咽癌干细胞活性。研究方法1.细胞和培养条件：本实验所用细胞均由本实验室保存。人鼻咽癌细胞株均培养于含10%小牛血清的改良型RPMI-1640培养基,于37℃、5%CO2培养箱内培养。2.平板克隆实验：胰酶消化对数期生长的贴壁细胞后制成单细胞悬液,六孔板中每孔加入200个细胞,加入2m1含10%小牛血清的RPMI-1640培养基,待形成明显的细胞集落时4%多聚甲醛固定15min,PBS清洗后苏木素染色10min,观察克隆数目及大小形态。3.Transwell迁移实验：胰酶消化细胞后以无血清培养基洗涤细胞并制成细胞悬液（细胞数为5X104）,加100u1无血清培养基重悬至transwell小室上腔,加入500u1完全培养基至1transwell小室下腔,于370C、5%C02培养箱内培养18-22小时后取出,PBS洗涤后4%多聚甲醛固定10min,吉姆萨染色（A液1min,B液5min）,PBS洗涤后晾干,用刀切下膜,中性树脂封片,显微镜下计数穿膜细胞数。4.Transwell侵袭实验：提前4h配置Matrigel基质胶（24ug/孔,45u1/孔）,胰酶消化细胞后以100ul无血清培养基重悬细胞（细胞数为5X104）加入transwell小室上腔的Matrigel基质胶表面,transwell小室下腔加入500ul完全培养基作为趋化物。于37℃、5%C02培养箱内培养19-22h后,PBS洗涤后4%多聚甲醛固定10min,吉姆萨染色（A液1min,B液5min）,PBS洗涤后晾干,用刀切下膜,中性树脂封片,显微镜下计数穿膜细胞数。5.MTT检测：将对数生长期的贴壁细胞消化重悬后接种到96孔板中,每孔10000个细胞,200u1培基,37。C,5%C02培养箱中培养24 h,依浓度梯度加入药物。药物作用24h后每孔加20μ1 MTT,继续培养4h,将细胞培养液上清弃去,每孔加入150μ1DMSO,摇床混匀约10min。酶标仪490nm比色检测,绘制肿瘤细胞生长曲线。6.肿瘤球培养实验：无血清培养基配制：无血清培养基（serum free medium, SFM）由Ham’s DMEM-F12（1:1）、双抗 （1:100）、B27（1:50）、EGF（20ng/ml）、bFGF（20ng/ml）组成,将鼻咽癌CNE-2,5-8F细胞接种于10%小牛血清的RPMI-1640培养基中,待细胞处于对数生长期,用PBS液清洗,胰酶消化,消化后再用PBS清洗两次,置于低吸附皿中,悬浮于SFM中进行培养,5-7d后倒置显微镜观察肿瘤球大小、形态和数量。7.侧群细胞检测：将贴壁细胞胰酶消化后分离成单个细胞,离心后用含2%胎牛血清的1640培基（37。C预热）重悬,染色剂Hoechst33342标记,标记的细胞在37。C孵育箱孵育90min（避光,间断摇晃）,4。C低温离心,PBS洗涤,重悬,检测前加入Propidium Iodide标记死细胞,用流式细胞仪检测侧群细胞比例。8.提取蛋白、检测蛋白浓度和免疫印迹检测：配置裂解液,加入铺有药物作用24h的细胞中,在冰上作用30min后将蛋白挂下,4℃离心30min,取上清液,加入检测蛋白的工作液200u1/孔,37℃孵育30min后,酶标仪490nm比色检测,绘制标准蛋白曲线,将所有要检测的样品配平,根据分子量大小及所带电荷,蛋白质电泳分离,将电泳后分离的蛋白转至PVDF膜上,PVDF膜浸泡在封闭液中室温1h,一抗4-C孵育过夜,PVDF膜与二抗在室温下孵育1h,化学发光法检测。9.体内成瘤实验：40只3-4w的雌性裸鼠,体重约15-20g,进行裸鼠皮下成瘤实验,裸鼠背部皮下接种2×106个细胞（细胞用100μl按1：1RPM-1640培基和Matrigel悬浮）,待40只裸鼠肿瘤体积平均长到约100mm3左右,将荷瘤裸鼠随机分为5组,分别为空白组、顺铂组和高、中、低浓度SangA组,空白组灌胃给与生理盐水,每天一次；SangA组灌胃给与不同浓度SangA,每天一次；顺铂组腹腔注射给药,每周一次。定期观察肿瘤生长情况,记录小鼠体重变化,根据公式V=1/2 ab2（a为肿瘤的最长径,b为肿瘤的最短径）计算肿瘤体积,绘制肿瘤成长曲线。观察80天后处死老鼠,取出肿瘤组织,做HE染色。10..本课题所用统计学方法：所有数据均采用统计软件SPSS 16.0对实验结果进行统计学处理和分析,计量资料以均数±标准差（x±s）表示。各组裸鼠体重及肿瘤体积,抑制率,穿膜细胞数,克隆形成率,肿瘤球形成率及直径均采用单因素方差分析（One-way ANOVA）比较各组差异,如方差齐性,多重比较采用LSD法；如方差不齐,采用We l c h值,多重比较采用Dunnett T3法；在体肿瘤生长曲线的比较采用两因素方差分析（two-way ANOVA）比较各组间差异。P<0.05被认为有统计学差异。结果1. SangA抑制鼻咽癌细胞增殖、侵袭和转移的作用（1）MTT检测结果显示,与对照组相比,一定浓度的SangA对CNE2、5-8F细胞的增殖具有显著抑制作用（P<0.05）；（2）与对照组相比,1.6mg/ml、0.8mg/ml的SangA作用CNE2、5-8F细胞后比DMSO体外增殖速度减慢（P=0.000）；（3）体外迁移实验结果显示,与对照组相比,1.6mg/ml、0.8mg/ml的SangA作用于CNE2、5-8F细胞后的迁移运动能力下降（P=0.000）；（4）体外侵袭实验结果显示,与对照组相比1.6mg/ml、0.8mg/ml的SangA作用于CNE2、5-8F细胞后的侵袭运动能力下降（P=0.000）。2.SangA抑制鼻咽癌肿瘤干细胞的作用（1） SangA处理组较DMSO组肿瘤球形成率低（P=0.000）,肿瘤球直径小（P=0.000）：（2）相对DMSO组,SangA处理组和Cisplatin处理组均可降低细胞SP；（3） SangA处理CNE-2细胞后beta-catenin、ABCG2、c-myc、Bmi-1蛋白表达降低,SangA处理5-8F细胞后beta-catenin、c-myc蛋白表达降低；（4） SangA高、中、低剂量组体重趋势与对照组基本相似,与对照组无显著性差异（P=0.998,0.956,1.000>0.05）,说明SangA高、中、低剂量对荷鼻咽癌裸鼠的体重无明显影响。顺铂组则与对照组有显著性差异（P=0.017<0.05）,说明顺铂显著降低裸鼠的体重,表现出一定的毒副作用。与对照组相比,顺铂组（P=0.011<0.05）,SangA高、中剂量组（P=0.036,0.041<0.05）能抑制肿瘤的生长,SangA低剂量组与对照组无显著性差异（P=0.068>0.05）。说明SangA在一定剂量下能显著抑制肿瘤的生长,具有一定的抗肿瘤活性。（5）对照组裸鼠生存率为42.9%,顺铂组裸鼠生存率为57.1%,SangA高、低剂量组裸鼠生存率为85.7%,中剂量组为57.1%。对照组平均生存期为62.0天,中位生存期为57.0天；顺铂组平均生存期为59.7天,中位生存期>80天。SangA高、中、低剂量组平均生存期分别为78.4天、76天、75.8天,中位生存期均>80天。结果表明SangA对荷鼻咽癌裸鼠的生存期有一定的延长作用。结论1. SangA可抑制鼻咽癌细胞的增殖、侵袭和转移；2. SangA可选择性抑制鼻咽癌肿瘤干细胞。