猪CTLA-4胞外区的分子克隆、融合表达及免疫佐剂作用的初步研究

论文摘要

细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4 （CTLA-4）是活化T淋巴细胞的一种表面分子,与CD28分子竞争结合抗原提呈细胞（APC）表面的B7分子,在免疫应答中起负调节作用。CTLA-4的IgV区保持与B7分子结合的特性,但不能传递负调节信号。现有的研究资料显示,将人或鼠CTLA-4IgV区与目的抗原融合,能发挥靶向抗原提呈作用,有可能成为一种新型分子免疫佐剂。为了研究猪CTLA-4 IgV区的靶向抗原提呈作用,本研究从猪外周血分离淋巴细胞,经ConA刺激活化后提取总RNA,用RT-PCR扩增猪CTLA-4 IgV编码序列,将其克隆入T载体后进行测序,结果显示与已发表的猪CTLA-4 IgV区的核苷酸序列一致性为99.2%,氨基酸序列一致性也为99.2%,具有与B7分子结合的典型六肽基序（LYPPPY）。将猪CTLA-4 IgV编码序列插入原核表达载体pQE-31,用构建的重组表达载体pQE-CTLA4IgV转化大肠杆菌,在IPTG诱导下重组蛋白获得成功表达;对猪细小病毒（PPV）VP2蛋白进行亲水性和抗原性指数分析,选择亲水性和抗原性指数较高的主要抗原表位区（命名为VP2s）序列设计引物,以PPV基因组DNA为模板,用PCR扩增VP2s基因片段,将其克隆入原核表达载体pGEX-6p-1,构建成重组表达质粒pGEX-VP2s;再将VP2s基因片段插入表达载体pQE-CTLA4IgV ,获得重组表达载体pQE-CTLA4IgV-VP2s ;以pQE-CTLA4IgV-VP2s为模板,用PCR扩增CTLA4IgV-VP2s片段,将其克隆入原核表达载体pGEX-6p-1,构建成重组表达质粒pGEX-CTLA4IgV-VP2s;分别用pGEX-VP2s和pGEX-CTLA4IgV-VP2s转化大肠杆菌,重组菌经IPTG诱导后进行SDS-PAGE分析,结果显示成功表达预期大小的GST-VP2s和GST-CTLA4IgV-VP2s融合蛋白,表达产物主要以包涵体形式存在。Western-blotting结果显示,两种重组蛋白均能被PPV抗血清识别。用包涵体纯化法对GST-VP2s和GST-CTLA4IgV-VP2s进行纯化,以纯化的重组蛋白免疫小鼠,VP2s特异抗体测定结果显示,GST-CTLA4IgV-VP2s免疫组的ELISA和血凝抑制抗体产生时间均早于GST-VP2s免疫组,免疫应答高峰期的ELISA抗体滴度（1∶2560-1∶5120）和血凝抑制抗体滴度（1∶128-1∶256）均显著高于GST-VP2s免疫组。这些试验结果表明,猪CTLA-4 IgV区能作为分子佐剂促进融合抗原的免疫应答。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 综述一:细胞毒性 T 淋巴细胞相关抗原 4 的研究进展
• 1. CTLA-4 的发现
• 2. CTLA-4 的分子结构
• 3. CTLA-4 分子的免疫学功能
• 4. CTLA-4 分子的胞外区
• 参考文献
• 综述二:猪细小病毒疫苗研究进展
• 1. 弱毒疫苗
• 2. 灭活疫苗
• 3. PPV 疫苗的免疫程序
• 4. 新型疫苗展望
• 参考文献
• 研究内容一:猪 CTLA-4 IgV 区编码序列的克隆与表达
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 参考文献
• 研究内容二:PPV VP2 主要抗原表位区与猪 CTLA-4 IgV 区 的融合表达
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 参考文献
• 研究内容三:猪 CTLA-4IgV 区免疫佐剂作用的初步研究
• 1. 材料与方法
• 2 结果
• 3. 讨论
• 参考文献
• 结论
• 致谢