人/鲑降钙素嵌合基因在大肠杆菌中的串联表达

论文摘要

降钙素（Calcitonin,CT）是一种由32个氨基酸残基组成的多肽类激素,它广泛存在于哺乳动物的甲状腺和鱼类的后腮体中,其主要生理功能是参与体内的钙磷代谢,通过抑制破骨细胞的活性,促进钙在骨中的沉淀,从而降低血钙含量。天然降钙素中鲑鱼降钙素（sCT）的活性最高,约为人降钙素（hCT）的40倍。目前,鲑鱼降钙素已被广泛应用于临床。 为保证降钙素生物活性的同时尽量降低其在人体内的抗原性,本实验室人工合成了新型人/鲑降钙素嵌合基因（已申请专利）。为提高表达量,我们采用串联表达的方法。首先设计一小段柔性连接肽,经过SWISS-MODEL与3D-PSSM蛋白质结构预测,通过此短肽首尾相接的串联CT中降钙素的活性位点和抗原位点均可以得到充分暴露。因此,我们用同尾酶法构建了多拷贝串联基因表达质粒pLEX-nCT（n=1,2,3,4,5）（每段CT基因之间以编码连接肽的DNA连接）,并导入大肠杆菌GI724中表达。表达产物经SDS-PAGE检测,1-5拷贝串联CT基因的表达均不明显。Western blotting检测结果显示,串联CT具有人源降钙素的抗原性。本工作为降钙素基因工程的进一步研究和应用提供了实验基础。

论文目录

• 第一章 文献综述和立项依据
• 第一节 降钙素的研究概况
• 1 降钙素概述
• 2 降钙素的生物活性
• 3 降钙素的分子结构与生物活性
• 4 降钙素的临床应用
• 5 降钙素的分子生物学研究
• 第二节 研究课题的提出及立项依据
• 第二章 人/蛙降钙素嵌合基因的串联表达
• 第一节 人/蛙降钙素嵌合基因的合成
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 CT嵌合基因的合成
• 2.2 CT嵌合基因的克隆
• 3 讨论
• 3.1 偏爱密码子
• 3.2 基因沉默
• 第二节 柔性连接肽的设计
• 1 方法
• 1.1 同源模建
• 1.2 反向折叠
• 1.3 从头预测
• 2 结果与讨论
• 第三节人/鲑降钙素嵌合基因的串联表达
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 重组子的筛选和鉴定
• 2.2 表达产物SDS-PAGE及Western blotting检测
• 3 讨论
• 3.1 表达载体的选择
• 3.2 串联表达质粒的构建
• 3.3 Western blotting结果分析
• 总结
• 参考文献
• 致谢
• 论文发表情况