蚕蛹抗氧化多肽的制备及分离纯化研究

论文摘要

人类许多慢性疾病及衰老现象均和人体内的自由基水平失衡有关,外源性抗氧化剂可以帮助人们维持体内自由基的平衡。通过对具有抗氧化活性的天然食物进行研究、筛选和改性有可能开发出有效的抗氧化药物和保健食品蚕蛹蛋白是一种优质蛋白质资源,含有18种氨基酸,其中8种人体必需氨基酸含量超过氨基酸总量40%,其蛋白含量约为50%,是一种比大豆蛋白更具营养价值的优质蛋白质资源本论文研究了蚕蛹蛋白粉的提取,酶解工艺条件,多肽抗氧化活性的检测方法,以及蚕蛹多肽中具有DPPH·清除活性的多肽的分离纯化。1.蚕蛹蛋白粉的脱脂及前处理。选取常规溶剂正己烷,丙酮,乙酸乙酯,无水乙醇分别作为单一脱脂溶剂做脱脂优化,以脱脂率为指标,得到最佳脱脂溶剂为丙酮。以超声细胞破碎法,微波破碎法,去离子水浸泡法三种方法对蛋白粉进行破碎处理,以上清液中蛋白含量为指标,得到最佳的破碎处理条件为超声波100HZ,间隔2sec,破碎10min2.建立了蚕蛹多肽体外抗氧化活性的检测方法。检测了蚕蛹蛋白水解液的抗氧化能力,包括清除超氧阴离子、清除羟自由基、清除DPPH·、还原能力和防止脂质过氧化等方面的能力。实验结果表明蚕蛹蛋白酶解液在不同检测系统中均具有抗氧化能力,尤以对DPPH·清除活性最高,具有很好的开发利用前景。3.确定了蚕蛹蛋白进一步酶解的最佳工艺条件。以DPPH·清除活性为指标,经过单酶实验,得到最佳水解用酶:胃蛋白酶。经过L16（45）的正交试验,确定了胃蛋白酶的最佳酶解条件:50℃,pH1.5,加酶量为8000U/g,酶解时间6h,底物浓度为4%。4.以DPPH·活性为指标,分离纯化了蚕蛹多肽。确定了Sephadex G-25凝胶层析对蚕蛹多肽的最佳分离条件:洗脱液为去离子水,0.2mL/min的洗脱速度,10mg/mL的上样浓度,0.50mL上样量,此时蚕蛹多肽能被分离出3个峰,其中第3峰具有最高的DPPH清除能力。使用DEAE填料进行离子交换,第三峰分为五个峰,其中A峰DPPH·清除能力最高。A峰的HPLC分析进一步表明其为是单一的物质,通过质谱分析得到其为含酪氨酸基团分子量为892Da的基团。质谱分析得到这是一种含tyr的分子量为892的多

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 前言
• 1.2 抗氧化肽
• 1.2.1 抗氧化肽的作用机理
• 1.2.1.1 自身结构特点
• 1.2.1.2 与诱导氧化的过渡金属鳌合
• 1.2.1.3 直接与活泼自由基反应
• 1.2.1.4 具有供氢、供电子能力
• 1.2.1.5 具有协同作用
• 1.2.2 抗氧化能力的测定指标
• 1.2.2.1 清除自由基
• 1.2.2.2 还原力的测定
• 1.2.2.3 抑制脂质过氧化
• 1.2.2.4 金属螯合
• 1.2.3 影响抗氧化能力的因素
• 1.2.3.1 底物蛋白
• 1.2.3.2 蛋白酶
• 1.2.3.3 水解度
• 1.2.3.4 pH 值
• 1.2.3.5 温度
• 1.2.3.6 肽的化学结构
• 1.2.4 抗氧化肽的制备方法及原料
• 1.2.4.1 抗氧化肽的制备方法
• 1.2.4.1.1 提取法
• 1.2.4.1.2 化学水解法
• 1.2.4.1.3 酶法水解
• 1.2.4.1.4 发酵法
• 1.2.4.1.5 化学合成法
• 1.2.4.1.6 基因重组法
• 1.2.4.2 抗氧化肽的制备原料
• 1.2.4.2.1 动物性原料
• 1.2.4.2.2 植物性原料
• 1.2.5 抗氧化肽的分离、纯化现状
• 1.2.5.1 国外研究现状
• 1.2.5.1.1 植物蛋白方面
• 1.2.5.1.2 动物蛋白方面
• 1.2.5.2 国内研究现状
• 1.2.6 蚕蛹开发利用前景
• 1.3 本课题的研究背景、研究意义和主要研究内容
• 第二章 蚕蛹蛋白粉的制备及前处理
• 2.1 引言
• 2.2 材料与试剂
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 蚕蛹脂肪含量的测定
• 2.3.2 脱脂蚕蛹蛋白粉的制备
• 2.3.3 粗蛋白含量测定
• 2.3.4 蚕蛹蛋白预处理
• 2.3.5 酶解前后蚕蛹蛋白分子量变化
• 2.4 结果
• 2.4.1 蚕蛹脂肪含量的测定
• 2.4.2 脱脂蚕蛹蛋白粉的制备
• 2.4.3 粗蛋白含量测定
• 2.4.4 蚕蛹蛋白预处理
• 2.4.5 酶解前后蚕蛹蛋白分子量变化
• 2.5 本章小结
• 第三章 酶解对蚕蛹蛋白水解液抗氧化活性影响的研究
• 3.1 材料与试剂
• 3.2 实验仪器与设备
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 最佳水解酶的筛选
• 3.3.1.1 酶解液清除DPPH·能力
• 3.3.1.2 多肽含量的测定
• 3.3.1.3 蛋白酶对蚕蛹蛋白水解度的影响
• 3.3.2 胃蛋白酶水解工艺参数优化
• 3.3.3 酶解液体外抗氧化活性研究
• -·）自由基清除能力测定'>3.3.3.1 超氧阴离子（O2^-·）自由基清除能力测定
• 3.3.3.2 羟自由基（·OH）清除能力测定[8]
• 3.3.3.3 DPPH·清除能力测定
• 3.3.3.4 还原力的测定
• 3.3.3.5 抑制脂质过氧化实验
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 最佳水解酶的选择
• 3.4.1.1 酶解液DPPH·清除能力
• 3.4.1.2 酶解液多肽含量的测定
• 3.4.1.3 酶解对蚕蛹蛋白水解度的影响
• 3.4.2 胃蛋白酶水解工艺参数优化
• 3.4.3 酶解液体外抗氧化活性研究
• -·）自由基的清除能力'>3.4.3.1 酶解液对超氧阴离子（O2^-·）自由基的清除能力
• 3.4.3.2 酶解液对羟自由基（·OH）的清除能力
• 3.4.3.3 DPPH·清除能力测定
• 3.4.3.4 酶解液对还原力的影响
• 3.4.3.5 酶解液对脂质过氧化的影响
• 3.5 本章小结
• 第四章 抗氧化肽的分离纯化
• 4.1 实验材料与仪器
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 实验仪器与设备
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 多肽含量的测定
• 4.2.2 DPPH·清除率的测定
• 4.2.3 Sephadex G-25 凝胶层析
• 4.2.4 离子交换层析
• 4.2.5 反相高效液相色谱分析
• 4.2.6 质谱分析
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 Sephadex G-25 凝胶层析分离条件的确定
• 4.3.1.1 洗脱流速对Sephadex G-25 凝胶层析分离效果的影响
• 4.3.1.2 上样浓度对 Sephadex G-25 凝胶层析分离效果的影响
• 4.3.1.3 上样量对Sephadex G-25 凝胶层析分离效果的影响
• 4.3.2 离子交换层析条件的确定
• 4.3.3 反相高效液相色谱分析
• 4.3.4 质谱分析
• 4.4 本章小结
• 结论与展望
• 一、结论
• 二、创新点
• 三、展望
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 附件