基因重组HSV-TK腺相关病毒联合GCV治疗膀胱癌的实验研究

论文摘要

膀胱癌是我国泌尿系统最常见的恶性肿瘤，据统计大约75％的病例为浅表性膀胱癌，其中95％为高危浅表性肿瘤。高危浅表性肿瘤术后若不给予任何药物治疗，其近期复发率为60％-90％。手术、放疗、化疗构成了肿瘤治疗的三大模式。这些治疗方法基本都着眼于直接杀伤肿瘤细胞，常难彻底消灭肿瘤细胞又易伤及正常组织，特别是在治疗的同时会伤害在机体抗肿瘤防御机制中占重要地位的免疫系统，尤其是影响机体的细胞免疫。在现代分子生物学和基因工程技术的飞速发展的推动下，肿瘤的生物学治疗日益受到人们的重视，显示出良好的应用前景，成为肿瘤治疗的第四模式。基因治疗是生物学治疗的一个重要组成部分。其发展已有近三十年的历史，在肿瘤治疗中最具有潜力。据统计至1996年底，全世界接受基因治疗的患者总数达2103人，其中恶性肿瘤占68.8％。众多学者关注的自杀基因治疗是利用基因工程技术将一些病毒或细菌基因组中前药转换酶基因（也叫自杀基因）导人肿瘤细胞，该基因编码特殊的酶，可使原先对哺乳动物细胞无毒性的前药在肿瘤细胞中代谢为毒性产物，从而引起这些细胞的死亡，所以又称为“病毒导向的酶解前药疗法”或“分子化疗”。胸苷激酶（Thymidine kinase，TK）基因治疗就是其中之一，且其研究取得了令人瞩目的成就。该酶可将核苷类似物（NA）代谢为二磷酸化物，后者在细胞内酶的作用下生成有毒的三磷酸化物而发挥抗肿瘤作用，同时其能选择性地使抗病毒药物环氧鸟苷（Ganciclovir，GCV，目前肿瘤TK基因治疗中最常用的前药）磷酸化成为单磷酸化产物，并在细胞内磷酸激酶的作用下形成三磷酸产物，干扰、阻断DNA的正常合成和细胞增生。在肿瘤的治疗中，单纯疱疹病毒-胸苷激酶（herpes simplex virus-thymidine kinase，HSV-TK）基因被认为最有效，也是唯一被批准进入临床试验的自杀基因。其可将GCV转化为三磷酸GCV，后者代替脱氧三磷酸鸟苷酸结合于DNA链，阻止DNA链延长，选择性杀伤处于增殖分裂期的自杀基因细胞。介导HSV-TK的真核表达载体主要有逆转录病毒（Retrovirus）、腺病毒（Adenovirus，Ad）、腺相关病毒（Adeno-Associated Virus，AAV）等；也可不经载体介导直接将质粒裸DNA进行转导。在已经报道的各种涉及HSV-TK基因治疗的体内外试验中，由于选择的基因转移方法不同，可使HSV-TK发挥的作用不尽相同。本课题借助已被成功包装为有复制缺陷的含目的基因HSV-TK的腺相关病毒颗粒优势，结合细胞培养和动物饲养技术，进行杀伤膀胱癌细胞及裸鼠膀胱癌模型抑癌作用的实验研究。该项研究旨在为随后的动物原位模型体内试验、含两个或两个以上目的基因的肿瘤基因治疗实验等系列研究奠定理论基础，同时为膀胱癌等肿瘤疾病的治疗开拓一个新的研究平台。第一部分基因重组HSV-TK腺相关病毒联合GCV治疗膀胱癌的体外细胞实验研究目的：1．通过观察基因转染T24膀胱肿瘤细胞的效果，证明含目的基因HSV-TK的腺相关病毒基因转染T24细胞的可行性。2．利用HSV-TK腺相关病毒进行体外T24膀胱肿瘤细胞的实验研究，观察其对肿瘤细胞凋亡的影响、细胞生长抑制作用和时间-剂量依赖性。方法：1、以rAAV-EGFP转染T24膀胱肿瘤细胞，来确定腺相关病毒转染T24细胞的最适MOI值。2、已被成功包装为有复制缺陷的含目的基因HSV-TK的腺相关病毒对T24膀胱肿瘤细胞的进行基因转染并得到鉴定，来研究其可行性。3、体外培养膀胱肿瘤细胞系T24，接种于96孔板，分别加入rAAV-HSV-TK、rAAV-MCS重组腺相关病毒颗粒，并加入含不同浓度GCV，以不加GCV的细胞为对照，做MTT试验，研究rAAV-HSV-TK／GCV系统对T24细胞杀伤的剂量依赖性。4、体外培养膀胱肿瘤细胞系T24，接种于24孔板，加入rAAV-HSV-TK重组腺相关病毒颗粒，并参照GCV杀伤的剂量依赖性结果，每2天换含不同浓度GCV的新鲜培养液。从加GCV当天起，每天、每浓度做吖啶橙／EB染色计存活细胞，研究rAAV-HSV-TK／GCV系统对T24细胞杀伤的时间依赖性。5、流式细胞仪判断T24细胞的凋亡。6、用10μg／mLGCV作用于rAAV-HSV-TK组细胞24、48、72小时后，流式细胞仪检测细胞周期及DNA含量的变化，观察所研究rAAV-HSV-TK／GCV系统对T24膀胱肿瘤细胞周期的影响。结果：1、确定了腺相关病毒转染T24细胞的最适MOI值为1×106v.p.／cell。2、提取病毒感染后的细胞基因组，PCR扩增目的片段，1％凝胶电泳与预期序列一致，说明重组腺相关病毒具有生物活性，可以转染T24细胞。3、转HSV-TK基因T24细胞传代培养后，提取细胞基因组，PCR产物1％琼脂糖凝胶电泳及测序结果均正确，说明转HSV-TK基因T24细胞可以稳定携带TK基因。4、随着GCV浓度加大或GCV作用时间延长，T24细胞存活率大幅度下降，呈现明显的时间-剂量依赖性杀伤作用，而且对未转染细胞无明显毒副作用。5、rAAV-HSV-TK／GCV系统可以诱导膀胱肿瘤细胞凋亡。6、T24膀胱肿瘤细胞出现24～48小时期间受阻于G1期；而从48～72小时期间，受阻滞于S期，并且有明显的亚G1期峰出现，表示凋亡细胞能够占到10％左右的百分比。第二部分基因重组HSV-TK腺相关病毒联合GCV治疗膀胱癌的动物体内实验研究目的：构建裸鼠膀胱肿瘤模型，利用HSV-TK腺相关病毒联合GCV进行荷瘤裸鼠的实验研究，分析其抑瘤作用。方法：1、T24细胞悬液接种于裸鼠腋窝皮下，接种细胞数为4×106，SPF条件下饲养。2、取已成瘤裸鼠15只，随机分为3组：空白对照组、rAAV-MCS和rAAV-HSV-TK组（此组同时每天腹腔注射GCV 3mg／只），每组5只，测量各组裸鼠移植瘤体积，组间无差异（p＞0.05）。治疗4周后，颈椎脱臼处死荷瘤裸鼠，对移植瘤进行常规HE染色。各组裸鼠，处死后迅速取心、肝、脾、肺、肾组织，常规HE染色观察重组腺相关病毒对各器官是否有影响。结果：1、裸鼠接种膀胱肿瘤细胞T24后约3周，接种部位出现肉眼可见肿块，据此成功建立了膀胱肿瘤模型。2、各组裸鼠用药治疗，每3天测量各组体积，约9天后，瘤内注射rAAV-HSV-TK组的肿瘤受到显著抑制。治疗结束后，各组肿瘤的体积分别是：rAAV-HSV-TK组（0.71±0.11）cm3、rAAV-MCS组（1.27±0.13）cm3和空白对照组（1.24±0.17）cm3。统计分析：rAAV-HSV-TK组与阳性对照与阴性对照比较，差异均有显著性（p均＜0.05）；rAAV-MCS组与空白对照组比较，差异没有显著性（p＞0.05）。3、肿瘤组织石蜡包埋后HE染色，病理学检查验证皮下种植瘤。各组裸鼠心、肝、脾、肺和肾组织HE染色显微镜下观察，未见细胞变性或坏死。结论：体内外实验研究显示宿主细胞可以表达出目的基因，rAAV-HSV-TK／GCV系统能有效抑制膀胱癌。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 论文正文
• 前言
• 文献综述
• 第一部分:基因重组HSV-TK腺相关病毒联合GCV治疗膀胱癌的体外细胞实验研究
• 对象和方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第二部分:基因重组HSV-TK腺相关病毒联合GCV治疗膀胱癌的动物体内实验研究
• 对象和方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 结论及今后工作
• 参考文献
• 在学期间发表文章
• 致谢