PC12细胞的PSI诱导性包含体的亚细胞蛋白质组学

论文摘要

散发性帕金森病（sporadic Parkinson’ disease，sP D）等路易体疾病（Lewybody diseases，LBD）的病变过程主要涉及三个通路，即以蛋白质错误折叠（misfolding或malfolding）为主要特征的蛋白质聚集（protein aggregation）通路，以蛋白酶体功能障碍（dysfunction of proteasome）为主要特征的蛋白质分解障碍（impaired protein degradation）通路，和以线粒体（mitochondrion）功能障碍为主要特征的氧化应激（oxidative stress）通路；同时，三个通路之间通过相互重叠的支路彼此影响，从而使sPD的病理机制复杂而多样化。其中，蛋白酶体功能障碍、蛋白质错误折叠以及蛋白质聚集是目前有关路易（小）体[Lewy body（LB），或Lewy bodies（LBs）]形成机制的重要研究方向。在蛋白质组分析（proteomic analysis）被应用于揭示疾病病理机制的研究中，通过对大量蛋白质在疾病发生过程中发生变化的整体认识，可以获得与疾病相关的目的蛋白质（the protein of intrest）的具体信息。其中，含有目的蛋白质的细胞或细胞器或蛋白质复合体（protein complex）通过双向凝胶电泳（twodimensionalelectrophoresis，2 Delectrophoresis）分离，质谱（mass spectrometry，MS）分析、质谱数据在线检索（submission to search engine on line）和免疫组织（细胞）化学定位（localization）和（或）免疫印迹半定量分析（semiquantitative analysis）等是较为常见的蛋白质组学研究方法。在“PC12细胞的PSI诱导性包含体的亚细胞蛋白质组学”一文中，为了从蛋白酶体持续性抑制的PD细胞模型中分离和纯化蛋白质包含体，我们通过低速离心、核酸酶降解和密度梯度离心等生物化学分级分离（biochemical processes of fractionation）方法，从人工合成蛋白酶体抑制剂（artifically synthesized proteasome inhibitor，PSI）作用48小时（hour，h）的大鼠嗜铬细胞瘤细胞（rat pheochromocytomacell line，P C12）或副神经节瘤细胞中制备了PSI诱导性包含体（PSIinducedinclusions）；为了在蛋白质表达水平分析PSI诱导性包含体的蛋白质构成，通过双向电泳、基质辅助激光解析/电离-飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption/ionizationtime of flight MS）、和肽质量指纹（peptide massfingerpring，PMF）检索的蛋白质组学方法，我们建立了PSI诱导性包含体蛋白质组；为了在蛋白质组水平进一步地分析PSI诱导性包含体的构成特征，通过对被鉴定蛋白质所能提供的生物学信息进行的综合和归纳，我们关注了10个尚未报道的LBs内的分子伴侣蛋白（chaperone proteins）和（或）分子伴侣样蛋白（chaperonelikeproteins）；为了证明作为蛋白质二硫键异构酶家族[the protein disulfide isomerase（PDI）family]成员之一的脯氨酰羟化酶beta亚基（Prolyl4hydroxylasebeta Polypeptide，P4HB）参与了PSI诱导性包含体的形成过程，我们通过免疫细胞化学分析，在生物学意义上确认了这个蛋白质。

论文目录

• 提要
• 缩略词索引表
• 第一章 蛋白质降解障碍和路易（小）体（Lewy bodies，LBs）
• 1 LBs 内蛋白质的组成特征
• 2 LBs 形成的“聚集体相关过程”
• 3 LBs 内的蛋白质
• 4 LBs 的蛋白质组分析
• 5 立题依据和实验设计
• 第二章 PSI 诱导性包含体的形成、分离和纯化
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2 1 材料
• 2 1 1 试剂
• 2 1 2 仪器
• 2 2 方法
• 2 2 1 细胞培养
• 2 2 2 蛋白酶体抑制和细胞死亡
• 2 2 3 蛋白酶体抑制和PSI 诱导性包含体的形成
• 2 2 4 PSI 诱导性包含体的分离和纯化
• 2 2 5 PSI 诱导性包含体的鉴定
• 3 结果
• 3 1 细胞死亡
• 3 2 生物化学分级分离方法对分离和纯化PSI 诱导性包含体的影响
• 4 讨论
• 第三章 PSI 诱导性包含体的蛋白质组分析
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2 1 材料
• 2 1 1 试剂
• 2 1 2 仪器
• 2 2 方法
• 2 2 1 PSI 诱导性包含体蛋白质样品的制备
• 2 2 2 双向电泳和图像分析
• 2 2 3 质谱分析和数据检索
• 3 结果
• 3 1 PSI 诱导性包含体的双向电泳图谱
• 3 2 PSI 诱导性包含体的蛋白质组
• 4 讨论
• 第四章 PSI 诱导性包含体蛋白质组中的分子伴侣蛋白分析
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2 1 材料
• 2 1 1 试剂
• 2 1 2 仪器
• 2 2 方法
• 2 2 1 制备 PSI 诱导性包涵体蛋白质样品
• 2 2 2 双向电泳和图像分析
• 2 2 3 质谱分析和数据检索
• 3 结果
• 3 1 PSI 诱导性包含体的分子伴侣蛋白
• 4 讨论
• 第五章 脯氨酰羟化酶 beta 亚基（P4HB）的免疫细胞化学分析
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2 1 材料
• 2 1 1 试剂
• 2 1 2 仪器
• 2 2 方法
• 2 2 1 细胞培养
• 2 2 2 蛋白酶体抑制和 PSI 诱导性包含体的形成
• 2 2 3 PSI 诱导性包含体的分离和纯化
• 2 2 4 P4HB 的免疫细胞化学分析
• 3 结果
• 3 1 脯氨酰羟化酶 beta 亚基在PSI 诱导性包含体形成过程中的变化
• 4 讨论
• 第六章 结论
• 附录
• 附表 1
• 附图 1
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表的论文
• 中文摘要
• 英文摘要
• 致谢