石斛属植物亲缘关系研究及ACC氧化酶基因的克隆

论文摘要

石斛属植物为兰科多年生植物,是兰科最大的属之一,也是重要的园艺植物。石斛属植物除了具有较高的观赏价值外,还有部分品种也是我国传统中药中的重要药材。对石斛属植物的传统分类主要是依靠形态学和地理分布,分类的准确性较低,而且不同学者有不同的分类体系,往往得到的差异较大。近几年,分子标记已经应用在石斛的遗传多样性和亲缘关系分析的研究中。铁皮石斛又被称为黑节草,是药用石斛中最为珍贵的品种之一,常生长于海拔500-1600M的山间河谷的石头或树上。由于它的生境条件较为独特,自身繁殖能力较低,并且人们过度采挖,现在铁皮石斛的野生资源濒临灭绝。为保护铁皮石斛资源和增加药源,现已有许多学者在铁皮石斛组织培养快繁方面开展研究,但对铁皮石斛人工授粉获得种子后再进行无菌播种的研究和利用分子标记进行亲缘关系的研究相对较少。ACC氧化酶（1-aminocyclopropane-carboxylic oxidase）是乙烯合成演化中的-个关键酶。乙烯可以诱导如苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶、多酚氧化酶和几丁质酶的活性。有报道显示,铁皮石斛的生物碱含量与PAL的活性有着密切的关系。采用ISSR分子标记技术对收集到的26个石斛属材料进行了亲缘关系的分析,并研究了铁皮石斛人工授粉与无菌萌发的条件。此外,克隆了铁皮石斛的ACC氧化酶基因,并在大肠杆菌中得到了高效表达。主要研究结果如下：1.采用ISSR标记,对26个材料的亲缘关系进行了分析。从100条ISSR引物中筛选出5条引物对26个石斛材料DNA进行PCR扩增。共扩增出了70条带,其中63条具有多态性,多态性条带百分率为90.00%,平均为每个引物12.6条多态性带。2利用计算机软件DPS软件统计ISSR数据,得出所研究的26个材料遗传距离介于0.0334-0.7314之间；用UPGMA进行聚类,当遗传距离为0.43时,可以将26份材料聚为6大类群：第一类：尖刀唇石斛、迭鞘石斛、流苏石斛、束花石斛、玫瑰石斛、大苞鞘石斛、重唇石斛、兜唇石斛、金钗石斛、报春石斛、齿瓣石斛、串珠石斛、细茎石斛和铁皮石斛；第二类：美花石斛、长距石斛、短棒石斛、聚石斛、细叶石斛和竹枝石斛；第三类：鼓槌石斛和密花石斛；第四类：黑毛石斛和翅萼石斛；第五类：刀叶石斛；第六类：翅梗石斛。3.通过采用（1）异株异花授粉；（2）同株不同花序异花；（3）同花序异花授粉；（4）自花授粉；（5）对照（套袋后自然授粉）等方式进行人工授粉,结果表明铁皮石斛花在开放后的第2d至第4d时采用异株异花,且在每天上午10点以前的人工授粉成功率最高。4.选择通过人工授粉获得的健康种子（8个月种龄）进行无菌播种,结果表明,铁皮石斛种子萌发最佳培养体系：MS+NAA0.5mg/L+土豆汁10%+活性炭0.5%暗处理7天后转光培养。5.通过PCR的方法,从铁皮石斛的花中克隆了一个同源ACC氧化酶基因。克隆到的cDNA长度为970bp（在NCBI中登录号为JX679494）,含有一个编码314个氨基酸的蛋白质。6.构建了pET-28a-ACO原核表达载体,并转入大肠杆菌（Escherichia coli）中表达,获得1个与预测大小一致的外源蛋白。该研究为生物调控铁皮石斛的生物碱含量提供了理论基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 1 前言
• 1.1 石斛属植物概况
• 1.2 石斛属植物DNA分子标记研究进展
• 1.2.1 常见分子标记及其原理
• 1.2.1.1 限制性片段长度多态性RFLP
• 1.2.1.2 随机扩增多态性DNA（RAPD）
• 1.2.1.3 简单重复序列（SSR）
• 1.2.1.4 简单重复序列区间（ISSR）
• 1.2.1.5 扩增片段长度多态性（AFLP）
• 1.2.1.6 酶切扩增多态性序列（CAPS）
• 1.2.2 分子标记在石斛研究中的应用
• 1.2.2.1 种质资源鉴定研究
• 1.2.2.2 亲缘关系与分类研究
• 1.2.2.3 遗传多样性分析
• 1.2.2.4 遗传图谱的构建
• 1.3
• 1.3.1 铁皮石斛概述
• 1.3.2 石斛人工授粉研究进展
• 1.3.3 石斛组织培养研究进展
• 1.3.3.1 石斛属植物组织培养外植体的选择
• 1.3.3.2 基本培养基成分对石斛属植物组织培养的影响
• 1.3.3.3 植物生长调节剂对石斛属植物组织培养的影响
• 1.3.3.4 培养环境对石斛属植物组织培养的影响
• 1.4 ACC氧化酶基因研究进展
• 1.4.1 ACC氧化酶基因概述
• 1.4.2 国内外研究进展
• 1.4.2.1 乙烯调控苯丙氨酸解氨酶研究进展
• 1.4.2.2 苯丙氨酸解氨酶与生物总碱变化的研究进展
• 1.4.2.3 ACC氧化酶研究进展
• 1.5 本研究的立体依据及意义
• 1.5.1 石斛属植物亲缘关系的研究
• 1.5.2 铁皮石斛人工授粉及组织培养研究
• 1.5.3 ACC氧化酶基因的研究
• 1.6 研究内容
• 2 采用ISSR标记研究石斛属植物的亲缘关系
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 试验仪器
• 2.1.4 常用试剂配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 DNA的提取
• 2.2.2 模板DNA样品浓度及质量的测定
• 2.2.3 ISSR-PCR反应
• 2.2.3.1 PCR扩增反应体系优化
• 2.2.3.2 PCR扩增程序
• 2.2.3.3 引物筛选
• 2.2.3.4 电泳检测扩增产物
• 2.2.4 数据处理
• 2.2.4.1 谱带记录
• 2.2.4.2 ISSR标记共享度
• 2.2.4.3 统计数据
• 2.3 结果分析
• 2.3.1 DNA提取
• 2.3.2 引物筛选
• 2.3.3 ISSR反应体系及反应程序的优化
• 2.3.4 PCR结果
• 2.3.5 石斛亲缘关系分析
• 2.4 小结
• 3 铁皮石斛的人工授粉与无菌播种
• 3.1 材料
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 试验仪器
• 3.1.4 常用试剂配制
• 3.2 方法
• 3.2.1 人工授粉的方法
• 3.2.2 种子萌发
• 3.2.3 数据整理分析
• 3.3 结果分析
• 3.3.1 人工授粉
• 3.3.2 铁皮石斛种子在5种不同培养基上的萌发情况
• 3.3.3 不同植物生长调节剂对铁皮石斛种子萌发的作用
• 3.3.4 不同添加物对铁皮石斛种子萌发的作用
• 3.4 小结
• 4 铁皮石斛ACC氧化酶基因的克隆
• 4.1 材料
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 试验仪器
• 4.1.4 常用试剂配制
• 4.2 方法
• 4.2.1 铁皮石斛ACC氧化酶基因扩增与克隆
• 4.2.1.1 引物设计
• 4.2.1.2 RNA提取
• 4.2.1.3 cDNA合成
• 4.2.1.4 PCR扩增ACC氧化酶基因
• 4.2.1.5 ACC氧化酶基因的TA克隆
• 4.2.1.6 连接产物的转化
• 4.2.1.7 重组质粒的筛选和鉴定
• 4.2.1.8 目的基因序列测定及生物信息学分析
• 4.2.2 ACC氧化酶基因片段表达载体的构建
• 4.2.2.1 ACC氧化酶基因的扩增和TA克隆
• 4.2.2.2 ACC氧化酶基因片段和载体pET-28a（+）的制备
• 4.2.2.3 连接及转化
• 4.2.2.4 重组表达质粒的酶切鉴定
• 4.2.3 重组ACC氧化酶蛋白的表达与条件优化
• 4.2.3.1 ACC氧化酶基因片段的表达
• 4.2.3.2 表达条件的筛选优化
• 4.3 结果分析
• 4.3.1 RNA提取
• 4.3.2 PCR扩增
• 4.3.3 ACC基因片段测序结果
• 4.3.3.1 同源性分析
• 4.3.3.2 遗传进化分析
• 4.3.4 蛋白质组成结构、功能分析与三维结构模型构建
• 4.3.5 原核表达载体的构建
• 4.3.5.1 表达基因的T克隆
• 4.3.5.2 原核表达载体的构建
• 4.3.6 重组蛋白的表达
• 4.3.6.1 重组蛋白表达产物SDS-PAGE鉴定结果
• 4.3.6.2 表达条件的筛选结果
• 4.4 小结
• 5 讨论
• 5.1 影响ISSR反应的因素及26种材料聚类分析
• 5.2 铁皮石斛的人工授粉与无菌播种
• 5.2.1 关于铁皮石斛的人工授粉
• 5.2.2 关于铁皮石斛种子的无菌萌发
• 5.3 铁皮石斛ACC氧化酶基因的克隆
• 5.3.1 铁皮石斛总RNA的提取
• 5.3.2 ACC氧化酶基因的克隆
• 5.3.3 ACC氧化酶基因蛋白质组成结构、功能分析与三维结构模型构建
• 5.3.4 ACC氧化酶基因的原核表达
• 6 参考文献
• 附录 石斛属植物属下分类系统
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表的论文
• 本论文创新点