论文摘要
目的:1:探讨脓毒症CD4+CD25+Treg凋亡对CD4+效应T细胞免疫功能的影响及血必净注射液的干预作用。方法:1)体外实验:断颈处死Wister大鼠,无菌取脾脏,分离单个核细胞。1:免疫磁珠法（MACS）分离正常大鼠脾脏CD4+T细胞、CD4+CD25-T细胞、及CD4+CD25+Treg,以异硫氰酸荧光素（FITC）标记CD25,流式细胞术（FCM）鉴定细胞纯度,0.4%台盼蓝染色检测细胞存活率。2:将体外分离的CD4+CD25+Treg分为对照组、抗-CD3/CD28刺激组、抗-CD3/CD28+脂多糖（LPS）刺激组、抗-CD3/CD28+LPS+血必净组（5mg/ml）、抗-CD3/CD28+血必净组,于第3天以别藻蓝蛋白（APC）标记Annexin-V及放线菌素D（7-AAD）标记Treg,FCM检测细胞的凋亡率;藻红蛋白荧光素（PE）标记表面标志物叉头翼状螺旋转录因子（Foxp3）和T淋巴细胞毒性相关抗原4（CTLA-4）,FCM检测Foxp3和CTLA-4平均荧光强度;酶联免疫吸附试验（ELISA）检测IL-10分泌情况。3:将各组Treg分别与CD4+CD25T细胞1:1共培养,刀豆素（ConA）刺激68h,噻唑蓝（MTT）比色分析法检测T细胞增殖、ELISA法检测白介素2（IL-2）和可溶性IL-2受体（sIL-2R）及辅助性T细胞（Th）漂移因子干扰素γ（INFγ）/IL-4/IL-17的分泌。2)体内实验:复制盲肠结扎并穿孔（CLP）大鼠脓毒症模型,体外提取脾脏CD4+CD25+Treg培养过夜。1:将大鼠分为对照组、假手术组、CLP组,血必净组（4mg/kg）,于第3天检测FOXP3、CTLA-4、凋亡率、IL-10。2:将各组CD4+CD25+Treg与CD4+CD25-T细胞1:1共培养,ConA刺激68h,检测T细胞增殖、IL-2/sIL-2R、INFγ/IL-4/IL-17。结果:1)体外实验:1:Treg凋亡:对照组凋亡率各时间点之间比较无统计学意义（P＞0.05）;抗-CD3/CD28单克隆抗体诱导Treg凋亡率明显高于同时间对照组（P＜0.01）,达25-40%。Foxp3、CTLA-4与凋亡率呈负相关;抗-CD3/CD28+LPS刺激组凋亡率高于同时间对照组（P＜0.01）,稍低于抗-CD3/CD28刺激组,但无统计学意义（P＞0.05）,而Foxp3、CTLA-4与对照组比较并不随凋亡率增加而降低。2:对效应T细胞免疫功能的影响:①T细胞增殖:正常Treg能明显抑制Teff增殖功能,抗-CD3/CD28组和anti-CD3/CD28+血必净组明显高于对照组（P＜0.05）,抗-CD3/CD28+LPS较对照组明显降低（P＜0.05）,抗-CD3/CD28+LPS+血必净组与抗-CD3/CD28+LPS组比较有明显差异（P＜0.01）。②IL-2/sIL-2Ra的分泌:IL-2:抗-CD3/CD28刺激组较对照组明显升高（P＜0.01）;抗-CD3/CD28+LPS刺激组明显低于对照组和抗-CD3/CD28刺激组（P＜0.01）;抗-CD3/CD28+LPS+血必净刺激组较对照组、抗-CD3/CD28刺激组、抗-CD3/CD28+血必净刺激组明显降低（P＜0.05或P＜0.01）,而较抗-CD3/CD28+LPS组升高（P＜0.01）。sIL-2Ra:抗-CD3/CD28+LPS组较抗-CD3/CD28组有明显升高,抗-CD3/CD28+LPS+血必净组较抗-CD3/28+血必净组有明显升高。③Th1/Th2/Th17（IFNγ/IL-4/IL-17）漂移:INFγ和IL-4随凋亡增加而升高,抗-CD3/CD28+LPS+血必净组INFγ分泌明显高于抗-CD3/CD28+LPS组（P＜0.05）,而IL-4则呈相反变化（P＜0.05）,使IFNγ/IL-4升高P＜0.05);抗-CD3/CD28+血必净组IL-17较抗-CD3/CD28组有明显降低（P＜0.05）。2)体内实验:1:Treg凋亡:结果表明对照组Treg凋亡率为12.03±0.89%,假手术组（9.48±2.17%）和对照组比较无明显差异,CLP组凋亡率（5.87±0.44%）低于对照组（P＜0.05）,而血必净治疗组明显高于其他各组（P＜0.01）。Foxp3、CTLA-4表达和IL-10分泌功能随凋亡率增加而减少,成负相关。2:对效应T细胞免疫功能的影响:①T细胞增殖:MTT检测Teff增殖显示CLP组抑制率明显高于对照组（P＜0.01）,而血必净组抑制率低于CLP组和对照组（P＜0.01）。②IL-2/sIL-2Ra的分泌:CLP组IL-2分泌低于对照组（P＜0.05）,sIL-2Ra高于对照组（P＜0.05）;血必净组IL-2分泌高于CLP组（P＜0.05）,sIL-2Ra低于CLP组（P＜0.01）。③Th1/Th2/Th17（IFNγ/IL-4/IL-17）漂移:CLP组INFγ、IL-4和IFNγ/IL-4与对照组比较有明显升高（P＜0.05）;而血必净治疗组IFNγ、IL-4、IFNγ/IL-4明显高于CLP组（P＜0.05）;各组IL-17无明显变化。结论:1:抗-CD3/CD28能有效诱导脓毒症Treg凋亡,Treg凋亡后细胞接触机制和分泌功能下降。2:脓毒症Treg对效应T细胞具有强力免疫抑制功能,血必净注射液促进Treg凋亡后可有效改善其对效应T细胞的细胞免疫抑制作用。
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