论文摘要
适度运动有利于健康,运动超过一定限度达到力竭状态时则对机体造成一定的损伤。目前有关力竭运动损伤组织器官的研究主要集中在心脏,力竭运动可在分子水平和细胞水平造成心脏组织出现病理性改变,但是力竭运动对不同血管的影响尚缺乏研究。众所周知,支配血管的交感神经末梢囊泡内存在共递质NA和ATP。在血管神经源性收缩反应中,NA收缩成分和ATP收缩成分所占的比重可因动物的种属差异或血管的不同,而发生显著改变。在P2X受体中,P2X1受体是介导嘌呤核苷酸类激动剂收缩血管作用的主要受体亚型。α,β-methylene ATP （α,β-MeATP）是研究P2X1受体介导血管收缩的重要工具药,其给药方式尚无定论。因此,本研究分析了不同方式给予α,β-MeATP对大鼠离体肠系膜动脉P2X1受体介导血管收缩的影响;探讨了力竭游泳运动对大鼠不同血管α1受体和P2X1受体介导血管收缩反应的抑制作用;以及P2X受体亚型mRNA在不同血管的表达水平。第一部分不同给药方式对P2X1受体介导大鼠肠系膜动脉收缩反应的影响制备大鼠离体肠系膜动脉环标本。利用受体药理学技术观察和分析α,β-MeATP非累积给药和单浓度给药两种方式对P2X1受体介导大鼠肠系膜动脉收缩反应的药理学特征。1肠系膜动脉标本的反应性及标本湿重在α,β-MeATP非累积给药组、α,β-MeATP单浓度给药组和NA对照组,首次累积给予NA (0.001-100μmol·L-1)诱发浓度依赖性血管收缩反应。双因素方差分析结果显示,三组血管标本的NA量效曲线无显著性差异（P > 0.05）。三组肠系膜动脉的标本湿重分别为:0.82±0.16 mg、0.82±0.11 mg和0.86±0.05 mg,标本湿重在各组间比较无显著性差异（P > 0.05）。2两种方式给予α,β-MeATP诱发的肠系膜动脉收缩反应采用非累积给药或单浓度给药,α,β-MeATP (0.1-100μmol·L-1)均可使大鼠离体肠系膜动脉产生浓度依赖性收缩反应。无论以KCl最大收缩反应还是以标本湿重标化α,β-MeATP诱发的收缩反应时,α,β-MeATP单浓度给药诱发的收缩反应均显著大于α,β-MeATP非累积给药的效应（P < 0.01）。以标本湿重标化时,100μmol·L-1浓度的α,β-MeATP诱发的收缩反应分别是0.71±0.10 g·mg-1 （单浓度组）和0.44±0.12 g·mg-1 （非累积组,P < 0.01）。以KCl最大收缩反应标化时,100μmol·L-1浓度的α,β-MeATP诱发的收缩反应分别是48.57±11.52 % （单浓度组）和38.00±2.52 % （非累积组）。3 NA诱发的肠系膜动脉收缩反应前后两轮给予NA (0.001-100μmol·L-1)均产生浓度依赖性收缩反应。无论以KCl最大收缩反应还是以标本湿重标化NA诱发的收缩反应,前后两轮NA诱发的浓度效应曲线均无显著性差异（P > 0.05）。4 KCl诱发的肠系膜动脉收缩反应在α,β-MeATP非累积给药组、α,β-MeATP单浓度给药组和NA对照组,120 mmol·L-1 KCl诱发的收缩反应分别是1.05±0.12 g·mg-1、1.48±0.24 g·mg-1和1.46±0.17 g·mg-1。非累积组的KCl最大收缩反应显著低于单浓度组和NA对照组（P < 0.01）。第二部分P2X1受体介导大鼠五种动脉血管收缩效应的生理学意义本研究采用离体血管技术,通过与α1受体介导收缩反应的比较,观察P2X受体在大鼠胸主动脉、肺动脉、肠系膜动脉、颈内动脉和尾动脉介导收缩反应的药理学特征;以及α,β-MeATP和NA对麻醉小鼠颈总动脉血压的影响。1血管标本湿重及血管反应性胸主动脉、肺动脉、肠系膜动脉、颈内动脉和尾动脉五种去内皮动脉环标本均分为两组,一组用于观察NA第二轮量效曲线,另一组用于观察单浓度α,β-MeATP的血管收缩反应。结果表明:NA组与α,β-MeATP组比较,五种动脉的标本湿重以及标本的血管反应性无差别（P> 0.05）。2 KCl对胸主动脉、肺动脉、肠系膜动脉、颈内动脉和尾动脉的收缩作用在胸主动脉、肺动脉、肠系膜动脉、颈内动脉和尾动脉五种去内皮动脉环,NA组与α,β-MeATP组比较,KCl诱发的最大收缩反应无显著性差异（P > 0.05）。KCl诱发各动脉收缩反应的EC50值介于16.7729.89(mol·L-1)之间,α,β-MeATP组KCl诱发收缩反应的EC50值显著大于NA组（P < 0.05,P < 0.01）。3 NA对胸主动脉、肺动脉、肠系膜动脉、颈内动脉和尾动脉的收缩作用在胸主动脉、肺动脉、肠系膜动脉、颈内动脉和尾动脉五种去内皮动脉环,再次累积给予NA (0.0001-100μmol·L-1)诱发浓度依赖性收缩反应。以标本湿重标化NA诱发的收缩反应时,NA诱发最大收缩反应的序列为:尾动脉>肠系膜动脉>颈内动脉>肺动脉=胸主动脉;以KCl最大收缩反应标化NA诱发的收缩反应时,NA诱发最大收缩反应的序列为:颈内动脉>胸主动脉>肺动脉=肠系膜动脉>尾动脉。NA诱发收缩反应的-log EC50值(mol·L-1)为6.907.83,其效价序列为尾动脉=肠系膜动脉<颈内动脉<胸主动脉=肺动脉。4α,β-MeATP对胸主动脉、肺动脉、肠系膜动脉、颈内动脉和尾动脉的收缩作用在胸主动脉、肺动脉、肠系膜动脉、颈内动脉和尾动脉五种去内皮动脉环,α,β-MeATP (0.1-100μmol·L-1)诱发浓度依赖性收缩反应。以标本湿重标化α,β-MeATP诱发的收缩反应时,α,β-MeATP诱发最大收缩反应的序列为:尾动脉>肠系膜动脉>颈内动脉>肺动脉=胸主动脉;以KCl最大收缩反应标化α,β-MeATP诱发的收缩反应时,α,β-MeATP诱发最大收缩反应的序列为:颈内动脉=尾动脉>胸主动脉>肺动脉=肠系膜动脉。α,β-MeATP诱发收缩反应的-log EC50值(mol·L-1)为4.865.93,其效价序列是肺动脉=胸主动脉=颈内动脉<尾动脉=肠系膜动脉。在胸主动脉、肺动脉、肠系膜动脉、颈内动脉和尾动脉,以KCl最大收缩反应（% KCl Emax）标化后,α,β-MeATP最大收缩反应与NA最大收缩反应的比值(Emax·α,β-MeATP / Emax·KCl) / (Emax·NA / Emax·KCl)分别是0.42、0.42、0.41、0.43和0.80。5 NA和α,β-MeATP对小鼠颈总动脉血压的影响经尾静脉给予α,β-MeATP 10 nmol·kg-1后,小鼠颈总动脉血压在10 sec内升高并达峰值,2 min内恢复到药前水平。间隔20 min重复注入此剂量时,与第一次静脉给予α,β-MeATP比较,小鼠颈总动脉SBP、DBP和MBP升高值无明显差别（P > 0.05）。NA组与α,β-MeATP组比较,给药前的动脉血压未见显著差异（P > 0.05）;NA和α,β-MeATP在130 nmol·kg-1范围内升高SBP、DBP和MBP,并呈剂量依赖性。双因素方差分析结果显示,α,β-MeATP升高小鼠血压的作用明显强于NA （P < 0.01）。30 nmol·kg-1的α,β-MeATP使小鼠颈总动脉SBP、DBP和MBP值升高了65.83±17.15 mm Hg, 65.67±12.24 mm Hg和65.72±13.50 mm Hg,而同剂量的NA使小鼠颈总动脉SBP、DBP和MBP值升高了36.83±11.23 mm Hg, 33.33±12.01 mm Hg和34.50±11.53 mm Hg （P < 0.01）。第三部分力竭运动对大鼠不同血管α1受体和P2X1受体介导血管收缩反应的选择性抑制作用将大鼠分为力竭游泳组和对照组,力竭组大鼠尾部负重体重3%的负荷,游泳至力竭为止,每日游泳1次,每周游泳6次,共2周。两周后,采用离体血管技术和受体药理学技术观察α1受体和P2X1受体在大鼠肺动脉、尾动脉、肠系膜动脉和颈内动脉介导的收缩反应及药理学特征。1力竭游泳运动对标本湿重和KCl最大收缩反应的影响与对照组比较,力竭游泳组大鼠肠系膜动脉的标本湿重明显大于对照组,血管标本湿重分别是0.85±0.02 mg和0.73±0.02 mg （P < 0.01）。肺动脉、尾动脉和颈内动脉的标本湿重两组间未见明显差异（P > 0.05）。在肠系膜动脉和尾动脉,KCl诱发的最大收缩反应在力竭游泳组分别是1.46±0.06 g·kg-1和2.85±0.10 g·kg-1组织,在对照组分别是1.72±0.05 g·kg-1和3.27±0.10 g·kg-1组织,两组间比较差异具有显著性（P < 0.01）。在肺动脉和颈内动脉,KCl诱发的最大收缩反应在两组间无明显差异（P > 0.05）。在NA组中,KCl诱发收缩反应的EC50值(mmol·L-1)为17.2333.44,与对照组比较,力竭游泳运动对KCl的EC50值无明显影响（P > 0.05）。2肺动脉、尾动脉、肠系膜动脉和颈内动脉的反应性在肺动脉、尾动脉、肠系膜动脉和颈内动脉,首次累积给予NA (0.0001-100μmol·L-1)时,均产生浓度依赖性血管收缩反应。双因素方差分析结果显示:NA组与α,β-MeATP组比较,对照组大鼠各血管标本的收缩反应性无显著性差异（ P > 0.05）;同样,力竭游泳组大鼠各血管标本的收缩反应性无显著性差异（P > 0.05）。3力竭游泳运动对NA诱发肺动脉、尾动脉、肠系膜动脉和颈内动脉收缩反应的影响在肺动脉、尾动脉、肠系膜动脉和颈内动脉,再次累积给予NA(0.0001-100μmol·L-1)均产生浓度依赖性收缩反应。与对照组比较,力竭游泳运动明显抑制大鼠肺动脉和尾动脉NA诱发的收缩反应（P < 0.05）,其最大抑制率分别是13.68%和9.48%;与肺动脉和尾动脉相比,力竭游泳运动抑制肠系膜动脉NA诱发的收缩反应更明显,最大抑制率可达21.02% （P < 0.01）。而在颈内动脉,力竭游泳运动对NA诱发的收缩反应无显著影响（P > 0.05）。NA诱发收缩反应的-log EC50值(mol·L-1)为6.707.58,与对照组比较,力竭游泳运动对NA的-log EC50值无明显影响（P > 0.05）4力竭游泳运动对α,β-MeATP诱发肺动脉、尾动脉、肠系膜动脉和颈内动脉收缩反应的影响在肺动脉、尾动脉、肠系膜动脉和颈内动脉,α,β-MeATP (0.1, 1.0, 10和100μmol·L-1)诱发浓度依赖性收缩反应。与对照组比较,力竭游泳运动对肺动脉、肠系膜动脉和尾动脉α,β-MeATP诱发的收缩反应无显著影响（P > 0.05）;但是力竭游泳运动使大鼠颈内动脉α,β-MeATP诱发的收缩反应明显降低,最大抑制率为50.38% （P < 0.05）。α,β-MeATP诱发收缩反应的-log EC50值(mol·L-1)为4.716.19,与对照组比较,力竭游泳运动对α,β-MeATP的-log EC50值无明显影响（P > 0.05）。第四部分大鼠不同血管组织P2X受体亚型mRNA表达的研究本研究应用RT-PCR技术分析了大鼠颈内动脉、肺动脉、胸主动脉、肠系膜动脉和尾动脉五种血管P2X受体各亚型mRNA的表达;并进一步应用实时荧光定量PCR技术,探讨P2X受体mRNA在五种血管的相对表达水平。1 RT-PCR法检测P2X受体亚型mRNA在大鼠颈内动脉、肺动脉、胸主动脉、肠系膜动脉和尾动脉的表达琼脂糖凝胶电泳分析结果显示,在大鼠颈内动脉、肺动脉、胸主动脉、肠系膜动脉和尾动脉,管家基因HPRT mRNA扩增产物显示与预期相同的特异性扩增条带;P2X1、P2X4和P2X7受体mRNA扩增产物在各自相应泳道出现与扩增目的片段大小相同的特异性条带;P2X2、P2X3、P2X5和P2X6受体mRNA扩增产物未出现明显的特异性扩增条带。2大鼠颈内动脉、肺动脉、胸主动脉、肠系膜动脉和尾动脉P2X1、P2X4和P2X7受体mRNA表达的对比分析颈内动脉、肺动脉、胸主动脉和肠系膜动脉P2X1受体mRNA的表达水平无明显差异（P > 0.05）,但4者P2X1受体mRNA的表达水平显著低于尾动脉（P < 0.01）。P2X4受体mRNA在肺动脉、胸主动脉、肠系膜动脉和尾动脉的表达水平无差别（P > 0.05）。P2X7受体mRNA的表达水平为:肺动脉<尾动脉=胸主动脉<颈内动脉<肠系膜动脉（P < 0.01）。结论在大鼠离体肠系膜动脉,非累积给予α,β-MeATP显著降低P2X1受体介导的收缩反应以及高钾诱发的收缩反应。研究P2X1受体介导的血管收缩反应时,非累积给药方式可能导致错误的实验结论。与α1受体介导的收缩效应强度相比,P2X1受体介导的血管收缩效应强度在大鼠胸主动脉、肺动脉、肠系膜动脉和颈内动脉基本相同,而尾动脉中该收缩成分明显增大,提示嘌呤能血管收缩效应在尾动脉的生理功能上发挥着特殊作用。力竭游泳运动对大鼠颈内动脉P2X1受体和α1受体介导血管收缩反应的抑制作用不同于外周动脉。P2X1受体介导的外周血管收缩效应对力竭运动中的防御反应可能具有重要意义。P2X1受体mRNA在颈内动脉、肺动脉、胸主动脉和肠系膜动脉的相对表达量无明显差别,但显著低于尾动脉;P2X7受体mRNA的表达水平为肺动脉<尾动脉=胸主动脉<颈内动脉<肠系膜动脉;P2X4受体mRNA在五种血管组织的表达水平无显著差别。