超声分子成像评价三突变型低氧诱导因子-1α的促血管生成效应

论文摘要

背景和目的治疗性血管新生（therapeutic angiogenesis）是通过人为地向局部组织输送血管生长因子基因或重组蛋白的方式促进局部缺血组织血管新生,以达到改善缺血组织缺血缺氧和患者预后的目的。它的出现为缺血性心血管疾病的治疗提供了新的途径。在众多的血管生长因子中,低氧诱导因子-1 （hypoxia inducible factor-1, HIF-1）是细胞对缺氧作出适应性反应的关键性转录因子,在缺氧条件下可稳定表达,它通过对血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）等上百种靶基因的转录调控而促进这些基因表达,参与血管新生、红细胞生成等病理生理过程,可诱导生理功能完整的新生血管,促进侧支血管的灌注,在冠状动脉粥样硬化性心脏病和外周血管闭塞性疾病等涉及治疗性血管新生的疾病研究中,被认为是最具有临床治疗前景的基因。HIF-1由两个亚单位构成,氧调节亚单位HIF-1α和组成性表达的亚单位HIF-1β组成,HIF-1α受低氧诱导,决定HIF-1的活性。然而,由于其独特的结构,在常氧状态下,HIF-1α的氧依赖性降解区（oxygen dependent degradation domain, ODDD） 402位脯氨酸（Prolyl,Pro）和564位脯氨酸（Prolyl,Pro）容易被脯氨酸羟化酶所羟化而介导HIF-1α与E3泛素连接酶复合体组分vonHippel-Lindau肿瘤抑制蛋白（pVHL）相结合,进而启动HIF-1α经泛素-蛋白酶体途径降解；而转录激活区（transactivation domain, TAD） 803位天门冬氨酰（Asparageine, Asn）在HIF抑制因子（factor inhibiting HIF-1α, FIH）作用下发生羟基化,阻止HIF-1α与转录协同激活因子CBP/p300结合,抑制其转录活性。基于此,国外学者Tal等对HIF-1α的Pro402、Pro564和Asn803进行定点突变,并分别将Pro402、Pro564、Asn803三位点突变型HIF-1α基因（HIF-1α402/564/803）、Pro564、Asn803双位点突变型HIF-1α基因（HIF-1α564/803）和野生型HIF-1α基因（nature HIF-1α）转染人脐静脉内皮细胞,结果发现转染HIF-1α402/564/803的内皮细胞其血管生成活性明显高于转染HIF-1α564/803和nature HIF-1α者。然而,在体内,三位点突变型HIF-1α基因对缺血组织血管新生的影响却没有得到充分的评价,首先,该研究利用CD31免疫组化染色来评价促三突变型HIF-1α在小鼠缺血下肢模型中的促血管新生能力,但CD31并不是新生血管的特有标记,CD31阳性血管并不能代表新生血管；其次,在成年期,血管新生（neovascularization）过程中包括血管发生（angiogenesis）和小动脉生成（arteriogenesis）,而该研究只评价其对血管发生的影响而未涉及到它对小动脉生成的影响。最后,该报道使用多普勒血流灌注成像仅能对血流量进行间接评价而不能直接显示新生血管的分子靶点,不能对新生血管及早进行定量分析。超声分子成像是近年来兴起的一门无创性分子影像技术并已经实现了从分子水平对肿瘤性和缺血性血管新生的初步评价。它通过对超声造影剂微泡表面进行修饰,使其经静脉注入后靶向粘附、聚集并较长时间滞留于靶组织中,再通过对比超声（contrast-enhanced ultrasound, CEU）检查而产生分子水平的特异的靶向超声分子显影,旨在发现疾病过程中特定分子水平或细胞水平的异常,从而实现疾病分子水平上的特异诊断。和传统的影像学技术依靠其物理学和组织生理学的改变来发现疾病、对疾病进行定性相比,具有先进性。超声分子成像的关键是寻找“靶向目标”,并成功制备出与“靶向目标”具有高效、特异结合能力的靶向超声微泡。因此,如果能够构建出与新生血管特异结合的靶向超声微泡,将可以实现从分子水平对新生血管的无创性显影。大量的研究表明,新生血管内皮细胞表面表达大量的αvβ3-整合素,有利于微泡造影剂的粘附聚集,是理想的成像靶点。本实验室在前期的研究中已成功构建携αv-整合素单抗靶向微泡并实现基质胶新生血管的靶向显影。超声分子成像不但可以定性评价组织和器官的病理改变,还可以定量评价特定血管内皮事件的严重程度。Yeh等成功在小鼠心脏炎症模型中定量评价E-选择素的表达,结果表明E-选择素的表达量和E-选择素分子信号强度成正相关。我们实验室在肾脏微血管炎症模型中同样证实了微血管炎症程度与内皮P-选择素超声分子信号强度是正相关的。因此,在本研究中,我们将应用超声分子成像技术定量评价三突变型HIF-1α在小鼠缺血下肢中的促血管生成效应。方法1、动物模型的制备：对84只昆明小鼠（雌性,25～30 g）结扎一侧下肢股动脉制备下肢缺血模型,模型制备后将小鼠随机等分为4组,分别经肌肉注射40μl共4×108OPU腺病毒介导的β-半乳糖苷酶基因（Ad-LacZ, Ad-LZ）、腺病毒介导的野生型HIF-1α基因（Ad-nature HIF-1α, Ad-NH）、腺病毒介导的Pro564、Asn803双位点突变型HIF-1α基因（Ad-double mutant HIF-1α, Ad-DM）和腺病毒介导的Pro402、Pro564、Asn803三位点突变型HIF-1α基因（Ad-triple mutant HIF-1α, Ad-TM）.2、Real-time RT-PCR和免疫蛋白印迹（Western blot）:基因转染后第3天处死每组中3只小鼠,取注射局部肌肉组织行Real-time RT-PCR检测HIF-1α及其下游基因血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）、血管生成素-1 （angiopoietin-1, Ang-1）的表达情况；行Western blot检测人HIF-1α蛋白及下游VEGF蛋白的表达情况。3、对比超声灌注成像：在术前即刻、术后0、7、14、21和28天分别对小鼠双侧下肢骨骼肌行对比超声灌注成像评价缺血下肢骨骼肌的血流情况（n=6per group）。4、免疫荧光染色评价HIF-1α介导的血管新生（neovascularization）情况：术后第14、28天分别处死每组中3只小鼠,取注射局部肌肉组织行Bandeira simplificifolia-1 （BS-1）凝集素免疫荧光染色和α-平滑肌肌动蛋白免疫荧光染色分别标记微血管和小动脉,评价血管发生（angiogenesis）和小动脉生成（arteriogenesis）。5、超声微泡的制备及体外鉴定：生物素桥连法构建携αv-整合素单抗靶向微泡（MBav）和携同型抗体的对照微泡（MBiso）。采用库尔特计数仪测量微泡的平均粒径及浓度；采用绿色荧光标记二抗与αv-整合素单抗或同型抗体结合评价αv-整合素单抗或同型抗体与超声微泡的连接情况。6、靶向超声分子成像：治疗后第7天每组中6只小鼠分别经尾静脉随机注射MBav和MBiso （间隔30min）并于8分钟后行对比超声检查以评价血管新生情况。7、对比超声图像分析：（1）对于对比超声灌注成像,采用MCE软件分析缺血下肢和对侧非缺血下肢骨骼肌的血容量、血流速度、血流量并制作彩色编码图；（2）对于靶向超声分子成像：测量实验小鼠显影的声强度（Video intensity,Ⅵ）数值并制作彩色编码图。8、HE染色和αv-整合素免疫荧光染色：超声分子成像结束后,立即处死小鼠取缺血和非缺血下肢骨骼肌分别行HE染色和αv-整合素免疫荧光染色。结果1、Real-time RT-PCR结果显示：基因转染后第3天,HIF-1αmRNA在Ad-TM组的表达分别为Ad-LZ组的2.9倍（P=0.000）、Ad-NH的2.4倍（P=0.008）和Ad-DM的1.7倍（P=0.055）。其下游基因Ang-1 mRNA的表达在Ad-TM组较Ad-DM组显著增加（P=0.004）,该两组Ang-1 mRNA的表达均较Ad-NH组和Ad-LZ显著增加（P<0.05）,而Ang-1 mRNA的表达在Ad-NH组和Ad-LZ组之间无显著差异（P=0.145）。VEGF mRNA的表达在Ad-TM组较Ad-LZ组显著增加（P=0.007）,而其表达在Ad-TM组和Ad-NH组及Ad-DM组三者之间并无显著差异（P>0.05）。2、免疫蛋白印迹结果显示：Ad-LZ组不表达人HIF-1α蛋白,而转染三种不同亚型的HIF-1α均表达人HIF-1α蛋白,其表达量在Ad-TM组较Ad-LZ组、Ad-NH组和Ad-DM组均显著增加（F=102.943,P=0.000）。下游蛋白VEGF在不同治疗组均有表达；然而,Ad-TM组的表达量要显著高于Ad-NH组（P=0.013）和Ad-DM组（P=0.029）,而这三组的表达均显著高于Ad-LZ组（F=38.104,P=0.000）。3、对比超声灌注成像显示：术前双下肢血流量基本相等；术后0天,缺血下肢的血流量在Ad-LZ组、Ad-NH组、Ad-DM组和Ad-TM组分别为对侧下肢血流量的（16.9±2.7）%、（15.2±3.0）%、（15.9±2.1）%、（16.0±2.4）%,四组之间无显著差异（F=0.049,P=0.985）。所有治疗组缺血下肢血流量与对侧非缺血下肢血流量的比值均随着时间的推移而增加,其中以Ad-TM组的增加最为显著,术后28天时,Ad-TM组缺血下肢的血流量达到对侧血流量的（89.3±5.4）%,显著高于Ad-LZ组的（57.0±4.6）%、Ad-NH组的（62.3±3.8）%和Ad-DM组（73.4±6.0）%（F=53.770,P=0.000）。4、BS-1凝集素和平滑肌α-肌动蛋白免疫荧光染色分别标记微血管和小动脉。定量结果显示：术后14天时,微血管密度（用微血管／骨骼肌纤维表示）在Ad-TM组（1.42±0.21）较Ad-LZ组（0.56±0.06）、Ad-NH组（0.77±0.08）和Ad-DM组（1.05±0.08）显著增加（F=44.829,P=0.000）。术后28天时,不同治疗组的微血管密度均较14天有所增加,但Ad-TM组（2.06±0.23）仍显著高于Ad-LZ组（0.80±0.08）、Ad-NH组（1.01±0.14）和Ad-DM组（1.47±0.17）（F=74.693,P=0.000）。术后14天,小动脉密度（用每高倍视野的小动脉表示）在Ad-TM组（7.0±1.58）较Ad-LZ组（2.4±1.14）、Ad-NH组（3.6±1.14）和Ad-DM组（4.0±2.12）显著增加（F=7.965,P=0.002）。和术后14天相比,术后28天各治疗组小动脉密度均有不同程度的增加,但是Ad-TM组（15.2±2.59）仍较Ad-LZ组（6.4±1.67）、Ad-NH组（7.4±1.14）和Ad-DM组（10.4±1.95）显著增加（F=21.384,P=0.000）。这表明HIF-1α通过血管发生（angiogenesis）和小动脉生成（arteriogenesis）的方式促进缺血下肢血流的恢复,而三突变型HIF-1α具有较其他亚型更强的促血管生成效应。5、微泡制备情况：采用库尔特计数仪测得MBαv平均粒径为2.08±0.85μm,浓度为1.4±0.39×108/ml;MBiso平均粒径为2.07±1.13μm,浓度为1.5±0.31×108／ml。采用绿色荧光标记的二抗与一抗结合,荧光显微镜下观察显示MBαv和MBiso外壳均显示明亮的绿色荧光,这表明靶向微泡与对照微泡均构建成功。6、靶向超声分子成像：经尾静脉注射MBISO后8分钟,缺血和非缺血下肢均未见明显的超声显影；MBαv注入后8分钟,非缺血下肢未见明显的超声显影,而缺血下肢中可见明显的超声显影,且其显影强度在Ad-TM组较Ad-LZ组、Ad-NH组和Ad-DM组均明显增强。7、靶向超声图像Ⅵ值分析结果：对超声图像进行定量分析显示MBαv和MBiso在非缺血骨骼肌的Ⅵ值分别为（3.75±1.19）U和（3.80±1.08）U,两微泡组间无显著差异（t=-0.300,P=0.776）。而在缺血下肢骨骼肌中,Ⅵ值在MBαv组均显著高于MBISO组[Ad-LZ组分别为（10.92±1.97）U和（4.88±1.07）U,t=6.946,P=0.001;Ad-NH组分别为（14.11±2.79）U和（4.93±1.56）U,t=13.010,P=0.009;Ad-DM组分别为（18.77±3.53）U和（6.23±1.38）U,t=11.408,P=0.000; Ad-TM组分别为（25.23±3.10）U和（5.20±1.88）U,t=13.876,P=0.000].在所有MBαv中,Ⅵ值在Ad-TM组中较非缺血下肢组、Ad-LZ组、Ad-NH组和Ad-DM组显著增加（F=58.110,P=0.000）。而MBiso的Ⅵ值在所有治疗组中均未见显著差异（F=2.223,P=0.095）。8、下肢骨骼肌HE染色和αv-整合素免疫荧光检查：HE染色显示：非缺血下肢骨骼肌细胞形态正常,无充血、水肿；缺血下肢骨骼肌细胞水肿,内有炎症细胞浸润。免疫荧光显示：非缺血下肢未见αv-整合素表达,而缺血下肢可见αv-整合素表达于增殖发芽的血管内皮。其中,Ad-TM组中表达αv-整合素的血管多于其他三组。结论1、腺病毒介导的HIF-1α基因可通过血管发生和小动脉生成的方式促进缺血下肢血管新生,并且三突变型HIF-1α的促血管新生作用最强。2、采用“抗生物素蛋白／生物素复合体”可实现抗αv-整合素单抗与脂质微泡外壳的有效连接而成功构建携抗αv-整合素单抗靶向微泡。3、应用αv-整合素超声分子成像可定量评价HIF-1α介导的血管新生。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 综述
• 缩略词表（Abbreviation and Acronyms）
• 成果
• 附录
• 致谢
• 统计学证明