增强新疆家蚕抗菌肽核酸免疫效果方法的探讨

论文摘要

新疆家蚕抗菌肽（Cecropin-XJ）是一种含37个氨基酸,线性α螺旋,阳离子,具有热稳定性,广谱（革兰氏阳性细菌,革兰氏阴性细菌,真菌,肿瘤细胞等）杀菌能力的小分子肽。Cecropin-XJ对革兰氏阳性细菌的作用尤其明显。抗菌肽结构的多样性决定其功能和作用方式的多样性,因此抗菌肽的抗菌机制没有统一的解释。目前对于抗菌肽的抗菌机理主要存在有五种学说,并且主要集中在抗菌肽与细菌细胞膜作用方面。Cecropin-XJ的抑菌机制尚不清楚,为了探讨其抑菌机理,本研究采用核酸初次免疫,核酸加强的方法制备了小分子肽Cecropin-XJ的抗体。同时,对Cecropin-XJ进行了原核表达和纯化用于检测抗体。为研究其抑菌机制和抗菌肽转基因植物的检测提供了重要的工具。本研究工作主要包括以下两部分:1.新疆家蚕抗菌肽抗体制备及鉴定将新疆家蚕抗菌肽的基因片段（含有信号肽）从pGAPzα-Cecropin-XJ上用限制性内切酶（EcoR I和Not I）切下来亚克隆到pcDNA3真核表达载体上,构建真核表达载体pcDNA3-Cecropin-XJ,经过PCR,酶切和测序鉴定准确无误后,大提和纯化重组质粒。经过尾静脉注射方法验证在小鼠肝脏中表达后,肌肉注射Kunming小白鼠,100μg/100μL/只。每隔两周采血并且加强免疫,连续免疫12周,间接ELISA测定血清效价。同时采用三步层析法纯化由毕赤酵母表达的新疆家蚕抗菌肽,选取效价最高的一次,用免疫胶体金技术进行新疆家蚕抗菌肽在金黄色葡萄球菌的作用部位进行细胞亚定位。2.增强核酸免疫制备新疆家蚕抗菌肽抗体方法的探讨采用化学合成法合成含有4个新疆家蚕抗菌肽核心序列的基因片段Cecropin-XJ-4R（含信号肽序列）,将其从pUC57-Cecropin-XJ-4R上用限制性内切酶切下来亚克隆到真核表达载体pcDNA3上,构建重组真核表达载体pcDNA3-Cecropin-XJ-4R;与只含有一个核心序列的基因片段的重组真核表达载体pcDNA3-Cecropin-XJ的免疫应答水平进行比较;同时将含有4个核心序列的重组真核表达载体pcDNA3-Cecropin-XJ-4R与核酸佐剂pcDNA3-mIL4和不完全弗氏佐剂（IFA）混合共免疫Kunming小白鼠,比较小鼠的应答水平;采用注射部位预处理（注射盐酸普鲁卡因0.5%）和采用电击的方法比较小对重组质粒的应答水平;用pcDNA3-Cecropin-XJ免疫前3次,用pcDNA3-Cecropin-XJ-4R加强免疫后2次和用pcDNA3-Cecropin-XJ-4R免疫前3次,用pcDNA3-Cecropin-XJ加强免疫后2次,比较小鼠的应答水平;同时将定点突变的新疆家蚕抗菌肽核心序列的基因片段M8（不含有信号肽序列）亚克隆到原核表达载体上构建重组原核表达载体pGEX-4T-1-Cecropin-M8进行原核表达,并且诱导纯化出相应的重组蛋白,作为包被抗原检测抗血清。经过数据统计,含有4个cDNA数目的重组质粒和白介素4混合免疫的效果最好。鉴于核酸免疫所制备的抗体的特异性高,假阳性低,所产生的抗血清的滴度不高,以核酸免疫制备小分子肽的抗体仍然不失为一种有效且实用的好方法。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略语
• 第一部分 文献综述
• 小分子肽制备抗体方法的研究进展
• 参考文献
• 第二部分 实验内容
• 第一章 新疆家蚕抗菌肽的抗体制备及鉴定
• 1 材料及试剂
• 1.1 动物
• 1.2 菌株与质粒
• 1.3 试剂
• 1.4 主要实验仪器
• 2 方法
• 2.1 重组表达载体的构建
• 2.2 重组质粒的酶切鉴定
• 2.3 测序
• 2.4 测序结果分析
• 2.5 Cecropin-XJ 的原核表达
• 2.6 重组质粒的大量制备及纯化
• 2.7 鼠抗Cecropin-XJ 抗血清的制备
• 2.8 鼠抗Cecropin-XJ 抗血清的特异性鉴定
• 2.9 抗Cecropin-XJ 抗血清的ELISA 检测
• 2.10 方阵滴定法确定最适抗原包被浓度
• 2.11 新疆家蚕抗菌肽的纯化
• 2.12 免疫胶体金实验
• 3 结果
• 3.1 重组表达载体的构建
• 3.2 Cecropin-XJ 基因的原核表达
• 3.3 Western-blotting
• 3.4 鼠抗 Cecropin-XJ 抗血清的 ELISA 检测结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 第二章 增强新疆家蚕抗菌肽核酸免疫效果方法的探讨
• 1 材料及试剂
• 1.1 动物
• 1.2 菌株与质粒
• 1.3 试剂
• 1.4 主要实验仪器
• 2. 方法
• 2.1 重组表达载体的构建
• 2.2 重组质粒的酶切鉴定
• 2.3 测序
• 2.4 测序结果分析
• 2.5 真核质粒的大量提取
• 2.6 重组质粒稀释后的定量和酶切鉴定
• 2.7 Cecropin-M8 的原核表达及 SDS-PAGE 鉴定
• 2.8 GST-Cecropin-M8 的分离纯化
• 2.9 GST-Cecropin-M8 的定量
• 2.10 重组质粒pcDNA3-Cecropin-XJ 在小鼠肝脏中的瞬时表达
• 2.11 昆明白小鼠的分组
• 2.12 免疫策略
• 2.13 间接 ELISA 测定血清的效价
• 3. 结果
• 3.1 大提质粒的定量及酶切鉴定:
• 3.2 重组 GST-Cecropin-M8 的表达纯化及定量:
• 3.3 所提取 RNA 电泳鉴定以及水动力转染法的 RT-PCR:
• 3.4 免疫效果的比较
• 3.5 抗体稀释度
• 4. 讨论
• 参考文献
• 第三部分 结论与展望
• 致谢
• 个人简历