H5N1亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备与血凝素HA基因的体外高效表达和纯化

论文摘要

本研究以近年禽流感监测分离的H5N1亚型禽流感病毒毒株A/Chicken/Guangdong/S2261/2009（H5N1）和A/Chicken/Jiangsu /S1147/2010（H5N1）为免疫原免疫46周BALB/c鼠,三次免疫并加强免疫后取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,以两株病毒全病毒作为包被抗原进行ELISA检测、并进行血凝抑制试验（HI）检测筛选,阳性细胞经有限稀释法并进行间接的ELISA检测筛选,通过4次的亚克隆获得了6株杂交瘤细胞,均可以稳定地分泌抗HA的抗体,依次命名为GD2611A4、GD2612F5、GD2613D3、JS1471B5、JS1474D1、JS1475C5。对H5亚型HA特异性单抗亚类鉴定表明,GD2612F5和JS1474D1为IgM类,其余为IgG2a亚类,轻链均为κ链。经血凝抑制检测,HA特异性六株杂交瘤细胞可以和绝大部分禽流感病毒毒株结合,具有较好的广谱性和稳定性。染色体数值符合脾细胞与骨髓瘤细胞的染色体数目之和。六株杂交瘤细胞的HI效价依次为:212、212、211、210、212、210。血凝试验结果表明所制备杂交瘤细胞与禽流感病毒其他亚型及新城疫病毒无交叉反应。经冻存复苏后,仍具有较高的抗体水平,所获杂交瘤细胞均与感染了相应H5亚型AIV的293T发生特异性结合,捕获荧光标记的二抗,在荧光显微镜下发出明亮的绿色荧光。特异性的禽流感H5亚型的抗HA的单克隆抗体的成功制备,为AIV的监测、诊断及鉴别诊断提供良好的物质基础,为研究病毒HA抗原结构与功能提供物质手段。根据AIV HA株基因组序列,设计合成特异性PCR引物,通过常规PCR方法扩增禽流感H5亚型的HA基因,克隆得到的HA基因,定点插入到转移载体PFastbac1中成功构建重组的转移载体,构建好的重组转移载体转座DH10感受态,进而获得重组的转座子,通过转染昆虫细胞获得重组的杆状病毒,大量增殖悬浮培养获得表达蛋白,对蛋白进行常规的电泳转印及Western-blotting鉴定,同时做免疫荧光鉴定,鉴定阳性的蛋白用纯化带His标签蛋白的方法进行纯化,并将纯化好的蛋白经过凝胶过滤层析分离低聚物和三聚体,获得浓度较高并具有血凝活性的三聚体蛋白,为H5亚型流感病毒可能抗原结构位点的预测和定位提供基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略表
• 第一章 绪论
• 1.1 禽流感的概述
• 1.2 高致病性禽流感的爆发及其公共卫生意义
• 1.3 高致病性禽流感的分子生物学特性
• 1.4 禽流感病毒（Avian Influenza Virus, AIV）的生物学特性
• 1.5 血凝素 （Hemagglutinin HA）
• 1.5.1 HA 结构和功能
• 1.5.2 HA 裂解与流感病毒的致病性的关系
• 1.6 高致病性禽流感诊断及防制
• 1.7 本研究的目的与意义
• 第二章 针对流感病毒血凝素 HA 蛋白单抗的制备及鉴定
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 病毒株、细胞及实验动物
• 2.1.2 实验主要试剂
• 2.1.3 实验仪器及设备
• 2.1.4 实验主要溶液与其配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 动物免疫
• 2.2.2 饲养细胞的制备
• 2.2.3 小鼠的骨髓瘤细胞的准备
• 2.2.4 细胞融合
• 2.2.5 筛选阳性杂交瘤细胞
• 2.2.6 腹水制备及纯化
• 2.2.7 单克隆抗体的鉴定
• 2.3 结果
• 2.3.1 细胞融合率及阳性率
• 2.3.2 杂交瘤细胞的染色体数
• 2.3.3 抗体亚类鉴定
• 2.3.4 杂交瘤细胞稳定性检测
• 2.3.5 腹水效价的检测
• 2.3.6 广谱性检测
• 2.3.7 特异性检测结果
• 2.3.8 间接免疫荧光实验结果
• 2.4 讨论
• 2.4.1 免疫原的选择及小鼠免疫效果
• 2.4.2 杂交瘤细胞株的建立
• 2.4.3 单克隆抗体的制备
• 2.4.4 单克隆抗体的应用价值
• 第三章 血凝素 HA 基因的体外高效表达和纯化
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 引物
• 3.1.2 细胞株
• 3.1.3 载体和试剂
• 3.1.4 仪器设备
• 3.1.5 主要溶液及其配制
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 AIV HA 基因的扩增
• 3.2.2 重组原核载体PFastbac1-HA 的构建与鉴定
• 3.2.3 重组转座子的构建及鉴定
• 3.2.4 转染
• 3.2.5 免疫荧光检测
• 3.2.6 重组杆状病毒的扩大培养
• 3.2.7 表达蛋白的HIS 纯化
• 3.2.8 表达蛋白的鉴定
• 3.2.9 凝胶过滤层析结果
• 3.2.10 纯化蛋白的活性检测
• 3.3 结果
• 3.3.1 HA 基因扩增结果
• 3.3.2 转移载体和PCR 产物双酶切结果
• 3.3.3 重组质粒PCR 鉴定
• 3.3.4 重组转座子的PCR 鉴定结果
• 3.3.5 免疫荧光鉴定结果
• 3.3.6 His 纯化的蛋白的 SDS-PAGE 鉴定
• 3.3.7 His 纯化的蛋白的 Western-blotting 鉴定
• 3.3.8 重组蛋白纯化结果及鉴定
• 3.3.9 纯化蛋白的活性检测结果
• 3.4 讨论
• 3.4.1 本研究的目的
• 3.4.2 凝胶过滤层析条件的优化及实验结果的分析
• 3.4.3 需要解决的关键问题及创新点
• 3.4.4 研究成果的意义和应用前景
• 第四章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介