虾蟹混养池若干功能微生物的研究

论文摘要

本论文针对当前水产养殖现行使用的微生物制剂作用时效短,在使用过程中优势地位不明显等缺陷,基于微生态理论,在对虾蟹混养池天然生态系主要细菌类群调查的基础上,以胞外酶为指标分离筛选能高效降解水产养殖残余饵料蛋白、淀粉作用的功能菌,同时结合PCR-DGGE等分子生态技术,对虾池原位环境中优势功能菌群进行研究。研究取得以下主要结果:1.利用平板计数方法对养殖环境中功能微生物进行了调查,结果表明,在整个养殖期内,新旧养殖池水体和底质中可培养异养菌数均呈现较大的波动幅度,其它功能菌与异养菌相似,在整个养殖周期也呈现较大的波动性。新池水体的功能菌数量要高于旧池,而旧池表层沉积物的功能菌数量要高于新池,一般底泥环境的微生物数量要比水体环境数量高1-2个数量级。统计分析表明,养殖环境中的淀粉降解菌菌数、有机磷降解菌菌数、油脂降解菌菌数、弧菌数等与可培养异养细菌菌数之间呈现着明显的正相关,而几丁质降解菌菌数、无机磷溶解菌菌数、纤维素降解菌菌数以及硫氧化细菌菌数与可培养异养菌菌数之间则无明显的相关关系。2.利用选择性培养基从养殖环境中分离并筛选出6株具有较高淀粉酶和蛋白酶活性的菌株,对其发酵条件以及粗酶液性质进行了初步的研究。其中菌株SL-9、S-32与OP-8具有较高的淀粉酶活性,最适作用温度均为50℃,最适作用pH值分别为9.5,8.0,9.0;而菌株NOPL-2、SL-1以及O-19具有较高的蛋白酶活性,最适作用温度分别为60℃,50℃,40℃,最适作用pH值分别为8.5,7.0,8.5,几株菌均在碱性条件下具有较高的胞外酶活性。菌株OP-8和NOPL-2所产生的酶蛋白对热不敏感,另外四株菌所产生的酶蛋白对热敏感。3.克隆6株菌的16S rRNA基因并测序,系统发育分析6株细菌分属于芽孢杆菌、沙雷氏菌属、节杆菌属以及假单胞菌属。4.菌株SL-9、SL-1以及OP-19还具有较高的脂肪酶活性;NOPL-2还具有淀粉酶和磷酸酯酶活性;OP-8和S-32还具有蛋白酶活性等多种其它的胞外酶活性,以上结果表明这些功能菌株并不只是分泌单一的胞外酶,它们具有多种复合酶系,可为进一步筛选优良的复合酶微生态制剂候选菌株奠定基础。5.提取沉积物样品和功能菌的总DNA,利用通用引物对其V3可变区的16Sr RNA基因进行PCR扩增,将扩增所得的长约200 bp的PCR产物进行梯度凝胶电泳（DGGE）,最后对两者的电泳图谱进行比较,将迁移至相同位置的条带切胶回收测序,结果显示纯菌的序列与原位环境总DNA的序列的系统发育学地位相距较远,由此推测筛选获得的功能菌在原位环境中可能并未占据优势地位,可能是它们更适合于所提供的培养基才得以被培养和分离。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1. 前言
• 1.1 对虾养殖业现状
• 1.2 养殖生态系统脆弱的根源
• 1.2.1 养殖池生态结构的特殊性
• 1.2.2 养殖生态环境的污染
• 1.2.3 养殖生态环境污染的结果
• 1.3 养殖池的微生态调控
• 1.3.1 微生物在养殖生态系统中的地位和作用
• 1.3.2 养殖环境的微生态调控措施
• 1.4 微生态制剂在水产养殖中的应用
• 1.5 微生物分子生态学研究的主要方法与技术
• 1.5.1 分子杂交法
• 1.5.2 基因指纹图谱技术
• 1.6 本研究工作的意义及研究思路
• 2. 材料与方法
• 2.1 菌种
• 2.2 样品采集
• 2.3 工具酶
• 2.4 主要试剂
• 2.5 引物
• 2.6 主要软件
• 2.7 主要仪器
• 2.8 培养基
• 2.9 溶液
• 2.10 基本方法
• 2.10.1 细菌生理生化鉴定的基本方法
• 2.10.2 细菌分子鉴定的基本方法
• 2.10.3 原位环境优势菌的分析方法
• 2.10.4 酶活力测定的基本方法
• 3. 结果与分析
• 3.1 虾蟹混养池中主要理化因子的动态变化
• 3.1.1 虾蟹混养池的基本概况
• 3.1.2 理化因子的动态变化
• 3.2 虾蟹养殖池沉积环境中功能微生物的生态调查
• 3.2.1 不同养殖期养殖池水环境中可培养微生物数量的动态变化
• 3.2.3 不同养殖期养殖池表层沉积环境中可培养功能微生物数量的动态变化
• 3.3 虾蟹混养池沉积环境中产胞外酶的功能菌株的分离纯化
• 3.4 虾蟹混养池表层沉积物中功能微生物产胞外淀粉酶条件的研究
• 3.4.1 培养条件研究
• 3.4.2 酶液的性质
• 3.5 虾蟹混养池沉积物中产胞外蛋白酶菌株的功能菌株的筛选
• 3.5.1 培养条件研究
• 3.5.2 酶液的性质
• 3.6 分离菌株的其它胞外酶性质
• 3.7 几株具有高胞外酶活性菌株的细菌学鉴定
• 3.7.1 形态特征
• 3.7.2 生理生化特征
• 3.7.3 菌株165 rDNA 鉴定
• 3.8 虾蟹混养池沉积环境优势功能菌的研究
• 3.8.1 功能菌的V3 区165 rDNAPCR 扩增
• 3.8.2 原位沉积物总DNA 的提取
• 3.8.3 原位沉积物V3 区1651DNAPCR 扩增
• 3.8.4 功能菌与原位环境优势菌的DGGE 图谱比较
• 4. 讨论
• 4.1 虾蟹混养池理化因子的动态变化
• 4.2 养殖池水体和底泥环境中功能菌数量的动态变化
• 4.3 虾蟹混养池具有高胞外酶活性菌株的筛选
• 4.4 胞外淀粉酶和蛋白酶活性的研究
• 4.5 菌株的其它胞外酶活性
• 4.6 虾蟹混养池沉积环境中优势功能菌的研究
• 5. 结论与展望
• 参考文献
• 附录一：发表文章及参加的课题
• 附录二：DNA 分子量标准
• 致谢