抗Amp单抗的制备及牛奶中Amp残留胶体金免疫层析检测方法的研究

论文摘要

氨苄青霉素（ampicillin）简称Amp,属β-内酰胺类抗生素,常被用作奶牛的饲料添加剂或直接注射以治疗奶牛的乳腺炎,尿道、生殖道、胃肠道、呼吸系统等感染,从而导致其在乳制品中的残留。Amp残留容易对人体产生致敏作用并且干扰发酵乳制品的生产。美国、欧盟及我国对该药物在乳制品中的残留限量都有明确的规定。本研究将Amp与牛血清白蛋白（BSA）偶联合成全抗原免疫Balb/c小鼠,再经细胞融合筛选等步骤制得抗Amp单克隆抗体;并对应用该抗体建立胶体金免疫层析快速检测Amp残留方法进行研究。主要内容如下:1)抗Amp单克隆抗体的制备采用戊二醛法将氨苄青霉素分别与牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）偶联,制备免疫用和ELISA检测用抗原。改良BCA-紫外结合法测得合成免疫和检测抗原的偶联率分别为23、7。免疫程序设计上分别做了50μg、75μg、100μg三个免疫剂量对照,并适当延长了免疫间隔时间,四免后小鼠效价最高达到64000,血清最低IC50值100ng/ml。通过杂交瘤技术将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,融合率达95.7%,ELISA筛选阳性率为4.08%。并最终筛得两株特异性和敏感性均较好的细胞株2C1和8D6扩大培养后制备腹水单抗。采用辛酸-饱和硫酸铵法纯化腹水,纯化后的腹水单抗2C1和8D6蛋白浓度分别为4.16 mg/ml、3.53mg/ml,ELISA检测效价分别为128000和256000,IC50值分别为12.5ng/ml和6.25ng/ml。与青霉素、阿莫西林、头孢氨苄等β-内酰胺类抗生素有一定程度的交叉反应,与其他非青霉素类抗生素无交叉反应。2)Amp胶体金免疫层析检测方法的研究采用鞣酸常温还原制得40nm胶体金,通过光谱扫描、纳米粒度仪检测和透射电镜观察等多种方法鉴定,证明其颗粒形态和粒径均匀度均优于传统柠檬酸钠法。利用鞣酸还原法制得的胶体金标记抗Amp单克隆抗体,对建立胶体金免疫层析快速检测Amp残留方法进行研究。确定最适抗体标记量为8gg/ml,最佳标记pH为8.2。材料筛选结果组合为:NC膜MP25,结合释放垫VJ25,样品垫F50,吸水纸SX27。检测线抗原包被浓度为0.25mg/ml,金标抗体浓缩后4×稀释。成品试纸条PBS溶液中Amp的检测限为50ng/ml,牛奶加标样品中Amp的检测限为100ng/ml,检测范围在0～1000ng/ml,可以检测较高浓度的Amp残留。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 抗生素概述
• 1.1.1 青霉素类抗生素
• 1.1.2 氨苄青霉素
• 1.2 牛奶中抗生素残留检测方法研究现状
• 1.2.1 牛奶中抗生素残留的现状
• 1.2.2 牛奶中抗生素残留的影响及危害
• 1.2.3 各国对抗生素残留的监控和管理
• 1.2.4 牛奶中抗生素残留的检测方法
• 1.3 抗生素免疫检测方法的建立
• 1.3.1 人工抗原的合成
• 1.3.2 单克隆抗体的制备
• 1.3.3 检测方法的建立
• 1.4 胶体金免疫层析法概述
• 1.4.1 胶体金的特性及其制备
• 1.4.2 免疫胶体金的制备和纯化
• 1.4.3 胶体金免疫层析试纸条结构及检测原理
• 1.4.4 胶体金免疫层析技术现状及其应用展望
• 1.5 选题意义及研究内容
• 1.6 课题创新点
• 第2章 抗Amp单克隆抗体的制备及鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.1.1 试剂原料
• 2.1.1.2 设备和器材
• 2.1.1.3 试剂配制
• 2.1.1.4 其他
• 2.1.2 方法
• 2.1.2.1 Amp全抗原的合成及鉴定
• 2.1.2.2 免疫程序的设计和实施
• 2.1.2.3 小鼠血清效价及抗体敏感性的检测
• 2.1.2.4 骨髓瘤细胞复苏培养
• 2.1.2.5 杂交瘤细胞的制备和培养
• 2.1.2.6 杂交瘤细胞的筛选和亚克隆
• 2.1.2.7 阳性细胞株的扩大培养和冻存
• 2.1.2.8 腹水单抗的制备和纯化
• 2.1.2.9 纯化腹水单抗的鉴定
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 Amp全抗原鉴定结果
• 2.2.2 小鼠血清效价及抗体敏感性检测结果
• 2.2.3 杂交瘤细胞制备及筛选结果
• 2.2.4 腹水单抗的鉴定结果
• 2.2.5 讨论
• 2.2.5.1 抗原制备
• 2.2.5.2 免疫程序的设计
• 2.2.5.3 小鼠血清抗体的检测
• 2.2.5.4 细胞融合及筛选
• 2.2.5.5 腹水单抗的制备
• 2.3 本章小结
• 第3章 牛奶中Amp残留胶体金免疫层析检测方法研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.1.1 试剂原料
• 3.1.1.2 设备和器材
• 3.1.1.3 试剂配制
• 3.1.1.4 其他
• 3.1.2 方法
• 3.1.2.1 胶体金的制备及鉴定
• 3.1.2.2 免疫胶体金的制备和纯化
• 3.1.2.3 试纸条组成材料的筛选
• 3.1.2.4 包被抗原浓度和金标抗体稀释度的选择
• 3.1.2.5 试纸条的组装和测试
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 胶体金质量鉴定结果
• 3.2.2 免疫胶体金的制备和纯化结果
• 3.2.3 试纸条组成材料筛选结果
• 3.2.4 包被抗原浓度和金标抗体稀释度的选择结果
• 3.2.5 试纸条的组装和测试结果
• 3.2.6 讨论
• 3.2.6.1 胶体金的制备
• 3.2.6.2 金标抗体的制备
• 3.2.6.3 试纸条组成材料的筛选
• 3.2.6.4 抗原及抗体浓度的选择
• 3.3 本章小结
• 第4章 结论与展望
• 4.1 结论
• 4.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间的研究成果