柑橘采后青霉属病原菌生物学特性及其系统发育

论文摘要

在引起柑橘果实腐烂的真菌中,由青霉属病原菌导致的损失最为严重。本研究从柑橘各产区分离获得34株青霉属病原菌；结合不同培养基上的菌落形态特征,利用分子鉴定方法,将34株青霉属病原菌鉴定到种的水平；测定了这些菌株对伏令夏橙（Citrus sinensis cv. Valencia）和国庆四号（C. unshiu Marc. cv. Guoqing No.4）等柑橘果实的致病性强弱；利用扫描电镜和石蜡切片技术,观察青霉属病原菌对伏令夏橙果实的侵染过程；利用改良的生长速率抑制法,分析了34株病原菌对咪鲜胺的药敏感性;基于ITS、CO1和BenA等3种基因的碱基序列,利用Mega4.0软件,采用p-distance和NJ法,构建34株青霉属病原菌以及相关种的系统发育树,分析它们的发育位置和亲缘关系。主要研究结果如下：1.单独使用ITS、CO1和BenA等3个基因中的任何一个基因,都不能将34株病原菌鉴定到种的水平。结合传统形态学方法,参考它们3种基因的序列比对结果,将它们分为5个种。2.通过接种试验,发现指状青霉（Penicillium digitatum）和意大利青霉（P.italicum）对柑橘果实具有最强的致病性。接种产黄青霉（P chrysogenum）的柑橘果实不发病。皮落青霉（P. crustosum）和波兰青霉（P. polonicum）的致病性介于它们之间。它们对宽皮橘温州蜜柑和伏令夏橙的致病性是一致的。3.意大利青霉（P. italicum）、指状青霉（P. digitatum）和波兰青霉（P. polonicum）对咪鲜胺很敏感,EC50均低于3μg/ml。然而,大多数的皮落青霉（P. crustosum）对咪鲜胺却有较高的抗性。4.利用扫描电镜发现：指状青霉（P. digitatum）接种于伏令夏橙果实后,孢子附着于果皮表面。利用伤口处的营养,迅速生长、扩繁。通过石蜡切片观察指状青霉（P. digitatum）侵染伏令夏橙果实的过程,发现白皮层先于黄皮层出现降解现象。5.基于34株青霉属病原菌的ITS、CO1和BenA等3个基因的碱基序列,分析了它们的系统发育关系,确定了它们的系统发育位置。然而,它们的系统发育位置和亲缘关系随着基因的不同而出现差异。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1.1 中国柑橘生产情况
• 1.2 柑橘采后病害种类
• 1.3 青霉属传统分类学方法
• 1.4 分子生物学在青霉属鉴定和系统学发育中的应用
• 1.5 青霉属病原菌的防治方法
• 1.6 课题意义
• 2 试验材料与试验方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 病原菌
• 2.1.2 柑橘果实
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 培养基
• 2.2.2 柑橘采后青霉属病原菌菌株的分离、纯化
• 2.2.3 孢子悬浮液的配制
• 2.2.4 柑橘采后青霉属病原菌病原菌的保存
• 2.2.5 病原菌全基因组DNA的提取
• 2.2.6 ITS、CO1和BenA基因序列的扩增、连接、转化与测序
• 2.2.7 Blast序列比对
• 2.2.8 不同培养基的菌落形态特征
• 2.2.9 青霉属病原菌对国庆四号、伏令夏橙致病性的测定
• 2.2.10 SEM观察青霉属病原菌的侵染过程
• 2.2.11 石蜡切片观察青霉属病原菌的侵染过程
• 2.2.12 青霉属病原菌对咪鲜胺的药敏感性测定
• 2.2.13 分子系统发育树的构建
• 3 结果与分析
• 3.1 青霉属病原菌分离与纯化
• 3.2 分子鉴定结果
• 3.3 菌落形态特征描述
• 3.4 青霉属病原菌的致病性
• 3.4.1 病原菌对国庆四号致病性的聚类分析
• 3.4.2 病原菌对伏令夏橙致病性的方差分析
• 3.5 青霉属病原菌在柑橘果实上侵染过程的观察
• 3.5.1 SEM观察
• 3.5.2 石蜡切片观察
• 3.6 青霉属病原菌对咪鲜胺的药敏感性
• 3.7 青霉属病原菌的分子系统发育
• 3.7.1 基于ITS基因的青霉属病原菌系统发育
• 3.7.2 基于CO1基因的青霉属病原菌系统发育
• 3.7.3 基于BenA基因的青霉属病原菌系统发育
• 4 讨论
• 4.1 柑橘青霉属病原菌的种类
• 4.2 青霉属病原菌分类鉴定方法及分子系统发育
• 4.3 指状青霉在侵染柑橘果实中的致病机理
• 下一步研究计划
• 参考文献
• 致谢