论文摘要
课题目的:瘢痕疙瘩是一种病理性瘢痕,一直以来都是临床上的棘手问题,目前尚无理想的治疗方法。结缔组织生长因子（Connective Tissue Growth Factor,CTGF）是重要的促进纤维化因子,本研究的目的是:比较CTGF在体外培养的瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞中的表达,以及对血清刺激的反应;使用RNA干扰技术从转录后水平调控瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞中CTGF的表达,观察对成纤维细胞增殖以及细胞外基质合成的影响,从而了解CTGF RNA干扰能否起到逆转过度瘢痕增生的作用;研究介导CTGF在瘢痕疙瘩成纤维细胞中表达的信号途径、转录因子活化情况以及对CTGF启动子的调控,为阐明瘢痕疙瘩形成原因提供依据,并为治疗寻找新的、更具特异性的靶点。实验一CTGF在瘢痕疙瘩和正常成纤维细胞中差异表达及RNA干扰研究采用方法:使用定量实时反转录聚合酶链反应（q RT-PCR）比较CTGF及其下游基因-I型胶原在瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞中的表达。设计合成三条CTGF小干扰RNA（siRNA）序列并克隆到pRNAT-6.1/Neo载体中,分别转染瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞,24 h后行q RT-PCR检测CTGF和I型胶原的表达,细胞计数绘制生长曲线。主要结果:瘢痕疙瘩成纤维细胞表达的CTGF和I型胶原mRNA显著高于正常皮肤成纤维细胞（p<0.05）。瘢痕疙瘩成纤维细胞在血清刺激后1小时内CTGF的表达量迅速升高,峰值约为刺激前的8-17倍;与之相反,CTGF mRNA在正常皮肤成纤维细胞血清刺激后仅少量上升,约为刺激前的2倍。合成的三个CTGF siRNA载体均显著降低瘢痕疙瘩成纤维细胞的CTGF mRNA水平达一半以上,其中CTGF siRNA3的干扰效果最强（p<0.05）,并能显著减少瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞中的I型胶原mRNA水平（p<0.05）。CTGF siRNA3载体能显著降低瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞的增殖速度（p<0.05）,使瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖速度降低到近似于对照组正常皮肤成纤维细胞的水平。实验二CTGF在瘢痕疙瘩和正常成纤维细胞中差异表达的信号转导研究采用方法:血清刺激前半小时在培养基中加入放线菌酮至终浓度0.1mg/mL,特异性阻断新蛋白质的合成,q RT-PCR检测CTGF的表达。在血清刺激前半小时给予人工合成的小分子信号途径抑制剂进行预处理,分别为:PI3K抑制剂wortmannin,终浓度为100 nM;ERK抑制剂PD98059,终浓度为50 mM;p38 MAPK抑制剂SB203580,终浓度为10 mM;JNK抑制剂SP600125,终浓度为25 mM;以及TGF-βI型受体抑制剂SB431542,终浓度为0.1μM、0.5μM、1μM和10μM,空白对照组仅加入溶剂DMSO。分别于血清刺激后0、1、6、12、24 h收集RNA,行q RT-PCR检测CTGF的表达水平。分别在血清刺激后0 min、15 min、30 min、1 h、2 h、3 h、6 h和24 h收集瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞的蛋白质,行Western blot检测MAPK、PI3K和TGF-β信号途径分子的表达和磷酸化状态。主要结果:放线菌酮预处理后给予血清刺激,CTGF在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达不但不被抑制,反而出现显著升高（p<0.05）,说明了CTGF在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的血清反应不需要合成新蛋白质,而仅仅是通过改变信号蛋白的磷酸化状态和细胞内定位等就能完成,符合即刻早期基因的特征。在所研究的MAPK和PI3K信号途径抑制剂中,只有JNK抑制剂SP600125能够显著抑制血清诱导的瘢痕疙瘩成纤维细胞过度表达CTGF（p<0.05）,说明JNK信号途径参与了瘢痕疙瘩成纤维细胞在血清刺激后过度表达CTGF的过程。此外TGF-βI型受体抑制剂SB431542对血清刺激诱发的CTGF表达升高具有显著的抑制作用,并呈一定的量效关系,其中10μM组的抑制作用最强,CTGF的表达量仅为对照组的48%（p<0.05）。说明TGF-β信号途径也参与了瘢痕疙瘩成纤维细胞在血清刺激后过度表达CTGF的过程。Western blot发现ERK、P38和JNK的蛋白表达水平在血清刺激前后没有明显变化,然而其磷酸化水平在血清刺激后出现显著变化。对比瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞发现,ERK的磷酸化过程两者间并没有明显差异,然而P38和JNK的磷酸化在瘢痕疙瘩成纤维细胞中则明显强于正常皮肤成纤维细胞,表现在刺激后15分钟内磷酸化水平就出现显著升高,持续到刺激后的24 h;而在正常皮肤成纤维细胞中,P38的磷酸化发生相对较晚,到刺激后2 h才出现,24 h前就已经消失。正常皮肤成纤维细胞中JNK的磷酸化强度相对较弱,且在6 h之内消失。在瘢痕疙瘩成纤维细胞中ATF-2、Elk-1和c-JUN都在15分钟内迅速发生磷酸化,并且在24 h内都保持在高水平,而在正常皮肤成纤维细胞中,该磷酸化过程非常短暂。另外一些信号分子的磷酸化在瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞间没有差异,例如,P90、AKT、TGF-βI型受体和SMAD3。我们的研究证明,在瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞受到血清刺激后,多条信号途径都发生活化,包括ERK、P38、JNK、PI3K和TGF-β,其中JNK和TGF-β途径介导了瘢痕疙瘩成纤维细胞在血清刺激后过度表达CTGF的过程,而只有JNK途径在瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞间存在差异。实验三CTGF启动子分析和转录调控研究采用方法:以PGL3-basic载体为基础,构建出5个含有5’系列截短的CTGF启动子片段的报道基因载体,分别命名为:pCTGF-1999、pCTGF-736、pCTGF-625、pCTGF-140和pCTGF-72。使用CTGF启动子报道基因载体瞬时转染瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞,检测报道基因产物荧光酶的活性。将产生最强血清反应的pCTGF-625载体的AP-1结合位点和SMAD结合位点进行定点突变后转染瘢痕疙瘩成纤维细胞,检测报道基因产物荧光酶的活性。提取血清刺激前和刺激后1 h的瘢痕疙瘩成纤维细胞以及正常皮肤成纤维细胞的核蛋白,与AP-1结合位点或SMAD结合位点探针进行孵育,行凝胶迁移阻滞实验（Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA）分离蛋白-DNA结合的条带,分别加入c-Jun、SMAD2和SMAD3抗体行超迁移实验。主要结果:基础状态下,瘢痕疙瘩成纤维细胞中CTGF的启动子活性显著高于正常皮肤成纤维细胞,启动子-140到-72的片段对瘢痕疙瘩成纤维细胞CTGF基础水平的高表达具有重要的调节作用。而-625到-140的片段包含着血清反应调控元件。无论是AP-1结合位点还是SMAD结合位点的突变都足以消除CTGF启动子报道载体的血清反应,说明两个位点对瘢痕疙瘩成纤维细胞的CTGF高血清反应性都是必需的。超迁移实验发现与AP-1结合的条带能被c-Jun抗体超迁移,而与SMAD结合的条带能被SMAD2和SMAD3抗体超迁移,说明c-Jun、SMAD2和SMAD3均参与了血清刺激诱导的瘢痕疙瘩成纤维细胞中CTGF高表达。最终结论:瘢痕疙瘩与正常皮肤成纤维细胞存在着本质上的差异,表现在:①瘢痕疙瘩成纤维细胞的CTGF表达显著高于正常皮肤成纤维细胞,这种基础状态下的高表达由CTGF启动子-140到-72的片段调控;②瘢痕疙瘩成纤维细胞对血清刺激产生过度的反应,表现为高度表达CTGF。血清刺激后,瘢痕疙瘩成纤维细胞中出现一系列信号途径的活化,其中,正常活化的TGF-β信号和过度放大的JNK信号分别活化下游分子SMAD2、SMAD3和c-Jun,这三个转录因子在细胞核内形成复合物,与CTGF启动子-625到-140的片段上的SMAD和AP-1位点结合,协同介导了CTGF的高度表达。CTGF RNA干扰能抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的CTGF过度表达,产生抑制I型胶原表达和成纤维细胞增殖的生物学作用,因此具有治疗瘢痕疙瘩的应用前景。
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