论文摘要
氮素（N）是农作物产量的重要限制因子,铵态氮（NH4+）和硝态氮（N03-）是植物从土壤中吸收的主要矿质氮源。水稻（Oryza sativa L.）不仅是世界上主要的粮食作物之一,而且是单子叶作物研究的重要模式植物。在淹水条件下,水稻根系实际上处于铵硝混合营养中,越来越多的人关注N03-的研究,发现N03-对水稻的生长发育有重要的影响作用。在模式植物拟南芥中,研究发现CHL1、AtNRT1.2的功能是与硝酸盐吸收有关的。AtNRT1.4参与硝酸盐在叶柄的储存,AtNRT1.7促进了硝酸盐从老叶向嫩叶的转运和再利用,AtNRT1.6促进了硝酸盐向种子转运,AtNRT1.5参与了硝酸盐通过木质部从根系向地上部的长距离运输。然而关于水稻是如何吸收硝态氮生理与分子机制这方面报道还很少。本研究从水稻基因组中找到AtNRT1.2、AtNRT1.5的同源基因,命名为：OsNRT1.2、OsNRT1.5,利用农杆菌介导转化水稻武运粳7号和日本晴,对OsNRT1.2、OsNRT1.5进行获得性功能验证,构建了OsNRT1.2、OsNRT1.5基因的超量表达、RNAi基因沉默、MicroRNAs、蛙卵异源表达载体,转化水稻武运粳7号、日本晴和蛙卵；选取OsNRT1.2的武运粳7号超量表达株系W1.2-OE1、W1.2-OE2、W1.2-OE8;日本晴转基因株系1.2-OE1、1.2-OE5、1.2-OE6及OsNRT1.5的武运粳7号超量表达株系W1.5-OE2、W1.5-OE7、W1.5-OE8;日本晴转基因株系1.5-OE1、1.5-OE9、1.5-OE16,以野生型武运粳7号（WWT）、日本晴（WT）作为对照,进一步研究了基因OsNRT1.2和OsNRT1.5的表达调控和功能。主要研究结果为：1)通过生物信息学预测,OsNRT1.2序列全长为2178 bp,编码阅读框为1781 bp,编码593个氨基酸；OsNRT1.5全长为2240 bp,编码阅读框为1833 bp,编码610个氨基酸。通过氨基酸序列预测,OsNRT1.2和OsNRT1.5可能是硝酸盐运输蛋白,含有12次跨膜域,以及一个由24个氨基酸组成的中心环。OsNRT1.2和OsNRT1.5均由4个外显子和3个内含子,组织定位可能在细胞质膜上。2)半定量RT-PCR检测了OsNRT1.2和OsNRT1.5的时空表达模式。结果表明,OsNRT1.2、OsNRT1.5在武运粳7号、日本晴,表达存在器官特异性；OsNRT1.2主要在根系表达,地上部分几乎不表达。OsNRT1.5主要在地上部分表达,根系表达很少。3)采用农杆菌介导转化水稻分别超量表达OsNRT1.2和OsNRT1.5。分析检测结果表明：与野生型相比,在mRNA水平OsNRT1.2、OsNRT1.5在武运粳7号、日本晴超量转基因材料表达均上调并且在不同氮素水平处理下无显著差异；在转基因植株地上部分和根系,低亲和组成型OsNRT1.1和高亲和OsNRT2.1、OsNRT2.2的表达均没有变化。4) OsNRT1.2武运粳7号超量表达植株在水培试验中,用5.0 mM NO3-处理,株高与WWT有显著差异（除W1.2-OE2外）,比WWT增加了3.1～3.7 cm；根长、根系全氮含量显著降低,W1.2-OE1、W1.2-OE2、W1.2-OE8分别比WWT减少了3.3、2.5、4.5 cm和11.3%、10.9%、14.6%；氮吸收量比WWT分别增加了39.5%、33.9%、97.8%; W1.2-OE1、W1.2-OE2与WWT地上部分全氮含量没有显著差异,而W1.2-OE8是WWT的1.12倍。在0.2 mM NO3-供氮水平上,转基因植株与WWT的株高、根长（除W1.2-OE1外）、地上部分及根系的氮吸收量、全氮含量均无显著差异。在0.2 mMNO3-、5.0mM NO3-供氮水平上,转基因植株比WWT的生物量分别增加9.4%～31.1%和12.5%～43.8%。在缺氮的田间试验中,转基因植株地上部干重、根系干重比WWT,分别显著增加35.4%～57.2%和79.3%～120.9%。OsNRT1.2在武运粳7号过量表达可能受高浓度硝酸盐影响,促进植株对硝酸盐的吸收、生物量增加和根系生长。5) OsNRT1.2日本晴超量表达植株水培试验中,在0.2mM NH4+、5.0mM NH4+、0.2mM NO3-、5.0mM NO3-、2.5mM NH4NO3供氮水平上,与WT的根系长度变化无显著差异。在2.5 mM NH4NO3供氮水平上,WT、1.2-OE1、1.2-OE5、1.2-OE6株高分别增加了7.8 cm、20.2 cm、18.6 cm、27.2 cm; 1.2-OE1、1.2-OE5、1.2-OE6地上部分全氮含量比WT显著增加,分别增加了27%、18%、23%和15.6%、9.5%、19.2%；生物量分别是WT的1.9、1.3、2.2倍和1.8、1.7、2.7倍。在缺氮的田间试验中,转基因植株的株高、分蘖数、有效穗数、单株产量、千粒重、结实率、地上部分干重（除1.2-OE6外）、根系干重与WT无显著差异。6) OsNRT1.5武运粳7号转基因植株水培试验中,在5.0 mM NH4+、2.5 mM NH4NO3供氮水平上处理30天,W1.5-OE2、W1.5-OE7、W1.5-OE8干物质量比WWT分别增加了54.8%、74.6%、36.7%和68.5%、24.8%、31.5%；生长中期在5.0 mM NO3-、2.5 mM NH4NO3、5.0 mM NH4+供氮时,比野生型先分蘖,且根系粗壮。在缺氮的田间试验中,与WWT相比,武运粳7号转基因植株的单株产量（除W1.5-OE7外）、结实率、单穗粒数显著增加；株高、分蘖数（除W1.5-OE2外）、有效穗数（除W1.5-OE2外）、千粒重无显著差异。转基因植株提前分蘖,从而导致生育期提前,比野生型早成熟。OsNRT1.5在武运粳7号过量表达可能促使分蘖期提前,促进植株根系生长,从而促进植株生长、单株产量增加。OsNRTl.5在武运粳7号过量表达可能促进了氮素向籽粒的转运。7)OsNRT1.5日本晴转基因植株水培试验中,在5.0 mM NH4+供氮水平上,1.5-OE9比WT地上部分全氮含量显著增加了13.3%；在2.5 mM NH4NO3供氮水平上,1.5-OE1、1.5-OE9、1.5-OE16比WT地上部分全氮含量显著增加了14.5%-38.2%；在5.0 mM NH4+、2.5 mM NH4NO3供氮水平上,1.5-OE1、1.5-OE9干物质量显著增加,分别是WT的1.3、1.2、倍和1.9、2.1倍；在0.2 mM NO3-、5.0 mM NO3-、0.2 mM NH4+供氮水平上,地上部分全氮含量与WT无显著差异。在缺氮的田间试验中,转基因植株株高显著降低（除1.5-OE9外）,结实率和单穗粒数显著增加（除1.5-OE16外）,单株产量、分蘖数（除1.5-OE1外）、有效穗数、千粒重、地上部分干重（除1.5-OE9外）没有显著差异。