论文摘要
球孢白僵菌（Beauveria bassiana （Balsamo） Vuillemin）是目前国内外应用最广泛的昆虫病原真菌之一,能侵染15个目149个科的700多种昆虫,不同白僵菌菌株对不同昆虫的致病力存在很大差异。本研究以在不同寄主中分离纯化得到的白僵菌菌株HFW-05、TE-07、Lu-08、Dj-04为供试菌株,明确了四株供试菌株的种间分类和酯酶型、生物学特征;测定了四菌株对鳞翅目害虫小菜蛾、棉铃虫的毒力;通过扫描电镜观察了不同菌株分生孢子在同种昆虫和相同菌株分生孢子在不同昆虫的表皮侵染;在此基础上,明确了三种酶对菌株在表皮侵染过程中的作用,并克隆了四株白僵菌的几丁质酶基因。通过对四株球孢白僵菌ITS区序列和酯酶同工酶图谱分析,结果表明四株白僵菌为球孢白僵菌种下的不同酯酶型。测定四菌株对小菜蛾和棉铃虫2龄幼虫的毒力,结果表明,HFW-05菌株对小菜蛾致病力较高,6 d后校正死亡率为87.14%,其余三株均不高于40%,四菌株对棉铃虫6 d后校正死亡率均低于15%。扫描电镜观察显示:分生孢子在小菜蛾、棉铃虫体表的附着部位相似,多附着在凹陷部位、刚毛窝处、褶皱处、体壁嵴状突起之间,体壁的光滑部位分布较少。四菌株分生孢子在小菜蛾表皮附着12h后均可萌发,高致病力HFW-05菌株孢子萌发后直接穿透寄主表皮或产生较短穿透芽管,萌芽管贴于表皮生长,有些萌芽管末端弯曲指向表皮,在附着后16 h,萌芽管发生定向生长、垂直向里穿透表皮;其余三株低毒力菌株分生孢子的萌发、萌芽管的生长行为相似,只是萌芽管在穿透表皮之前伸的较长。供试菌株孢子在棉铃虫表皮均能萌发,但萌芽管呈蔓延生长无法穿透寄主表皮,感染36 h后的试虫表皮可观察到芽生孢子。结果表明菌株毒力大小与分生孢子在寄主体表的附着能力无直接相关性,但与萌芽管能否穿透表皮以及穿透时的伸长长度密切相关。用脂肪酶、蛋白酶K、几丁质酶三种单一酶液和脂肪酶+蛋白酶、脂肪酶+几丁质酶、蛋白酶+几丁质酶、脂肪酶+蛋白酶+几丁质酶四种复合酶液分别处理2龄小菜蛾、棉铃虫后,测定低毒力菌株对目标昆虫的毒力变化。结果显示,菌株对酶液处理后的试虫毒力均有一定程度的提高,其中对几丁质酶和含几丁质酶的复合酶液处理后的小菜蛾和棉铃虫毒力提高最明显。对小菜蛾6 d相对死亡率在单一酶液处理之间差异呈极显著（F=15.955,P<0.01）,其中几丁质酶处理后Lu-08菌株的死亡率是对照组的2.9倍,毒力提高最明显,脂肪酶处理后Dj-04菌株毒力为对照组的1.15倍;棉铃虫经三种单一酶液处理后,6 d后相对死亡率在酶处理之间差异性显著（F=17.695,P<0.05）,菌株对几丁质酶处理后的棉铃虫毒力提高最明显,菌株HFW-05、TE-07、Lu-08、Dj-04的死亡率分别为对照组的4.52、5.55、37.33、17.12倍。这在一定程度上反映出供试菌株分生孢子在穿透小菜蛾和棉铃虫体壁过程中,几丁质酶与供试菌株毒力相关性更显著。克隆四菌株几丁质酶基因并测序,几丁质酶基因的序列完全相同,编码区包括1047 bp,编码了348个氨基酸,分子量约为36.795 kD,进行同源性分析结果表明,与球孢白僵菌菌株NCIM1216（EU828354）和来源于小菜蛾虫生真菌球孢白僵菌几丁质酶基因（AY145440）的核苷酸同源性最高,同源性达到98%。氨基酸序列与球孢白僵菌菌株Bb0062几丁质酶（AAN41259）同源性达到99%。这可能与白僵菌中几丁质酶基因的多样性以及蛋白在侵染过程中的协调作用相关。