论文摘要
文蛤（Meretrix meretrix Linnaeus）是一种重要的海洋经济双壳贝类,近年来江苏沿海经常发生文蛤“菊花瘟”,引起了养殖文蛤的大规模死亡,严重影响了产业可持续发展。作者从流行病学调查、组织与细胞病理学、可疑病毒的分离纯化、病毒的人工感染试验以及病毒的鉴定等方面进行了系统研究,发现该病的发生与文蛤体内存在的一种水生双RNA病毒有关,该病毒是文蛤“菊花瘟”发生的病原。从养殖环境、文蛤机体特点等方面讨论了发病机理,并从改善养殖环境等方面讨论了文蛤“菊花瘟”的防控措施。发生“菊花瘟”的文蛤病蛤表现为消瘦、运动迟缓、摄食量减少、闭壳无力,发病不久便死于底泥中。于2003～2005年期间,分别选择江苏养殖文蛤的自然种苗区、自然繁殖增养殖区、围网养殖区以及辐射沙洲增养殖区等四种不同养殖模式的海区,对文蛤“菊花瘟”进行了调查。调查发现,文蛤“菊花瘟”呈现以下特点：主要发生区域为启东、如东两县；呈大规模暴发,死亡率高,低、中、高潮间带区死亡率逐步升高。养殖密度高的地区较密度低的地区死亡率高,近河口滩涂较远河口滩涂高,网围养殖较开放式养殖区死亡率高；主要流行时间为5月下旬到6月底以及9月上旬至10月上旬,发病期持续2-3周；发病期间海水温度为25～30℃,发病受海洋潮汐的影响。只发生在文蛤,其他滩涂贝类无类似疾病。从濒死文蛤体内外没有分离到可疑的细菌,也没有发现可疑的原生动物；疾病发生区域海水中的无机氮、铅、汞等理化指标未达到二类水质标准。采集2003年5月南通沿海发生“菊花瘟”的文蛤不同组织,用常规石腊切片法,进行了组织病理学研究。结果表明,患病文蛤各组织都发生了不同程度的病理变化,主要表现为：外套膜、鳃、消化管、足等上皮细胞肿涨、变性、破裂或脱落,结缔组织增生、变性或溶解,血淋巴细胞增多,肌纤维结构松散、断裂,组织中嗜碱性细胞增多；鳃组织发生坏死崩解；消化盲囊腺泡广泛受损,导管上皮及结缔组织发生溶解。对照组文蛤无上述病变。采用透射电镜观察了发病文蛤的超微结构和细胞病理学变化。结果显示：在病蛤的鳃、肝脏、消化管、外套膜等组织中有大量病毒样粒子的存在,该粒子呈球形或椭球形,无囊膜,直径在45～55nm,核心与核衣壳间无明显界限,大量存在于细胞间质及被破坏的细胞质中,少数存在于细胞核中,同时可见病毒包涵体的存在。被该病毒样粒子感染的细胞具有明显的病理变化,主要表现为：线粒体峭消失、固缩或溶解,内质网肿涨并空泡化,溶酶体数量增多,严重的多数细胞器消失,细胞溶解。上述结果提示,文蛤“菊花瘟”的发生可能与该病毒样粒子有关。采用差速离心、酒石酸钾垫超速离心与氯化铯密度梯度离心等方法纯化文蛤“菊花瘟”病毒,比较了蔗糖、酒石酸钾-甘油与氯化铯三种不同介质密度梯度离心的方法。研究表明,氯化铯密度梯度离心适合于该病毒粒子的分离提纯。经称量法得到文蛤“菊花瘟”病毒粒子在氯化铯中的浮力密度为1.554～1.582g/mL。透射电镜负染观察纯化的病毒粒子显示病毒粒子呈球形,二十四面体对称,无囊膜,直径60～75nm,表面粗糙,有明显的壳粒结构。利用已报道的水生双RNA病毒的引物PrB1:5’-GCCGACATCGTCAACTCCAC-3’, PrB2:5’-GACAGGATCATCTTGGCATA-3’,采用RT-PCR方法,以病毒RNA的cDNA为模板进行扩增,对文蛤“菊花瘟”病毒进行了鉴定。结果扩增出大小为524bp的目的条带,与文献所报道的水生双RNA病毒相符。通过差速离心与超微过滤相结合的方法,得到纯化的文蛤组织病毒液,人工感染健康文蛤。试验分六组进行,每组设试验文蛤20只,分别为病毒低浓度浸浴、病毒高浓度浸浴、活病毒注射、灭活病毒注射、生理盐水注射以及空白对照组（未做任何处理）。试验结果表明,病毒低浓度浸浴组、病毒高浓度浸浴组、活病毒注射组病毒可感染健康文蛤,使健康文蛤分别在第7、12、9天发生与自然条件下“菊花瘟”相同的症状,导致极高的（100%）死亡率；感染文蛤细胞发生同样的病理变化,体内可以再次分离到同样的病毒。试验结果分析认为,该病毒是导致文蛤“菊花瘟”发生的直接原因。综合以上研究认为,近年来发生在江苏沿海的文蛤“菊花瘟”是由病毒和环境二者共同作用的结果。水生双RNA病毒的感染是造成近年来文蛤“菊花瘟”发生的直接原因,而文蛤的养殖环境恶化（如高硫化物含量）、不合理的养殖模式（高密度养殖、围网养殖）、种质退化以及文蛤本身的生物学特性等则是造成文蛤“菊花瘟”发生的间接诱导因素,这些因素的变化超过了一定的限度,致使文蛤不能抵抗病原体的感染,导致疾病暴发而发生大规模死亡。通过调查和分析,提出目前可行的文蛤“菊花瘟”防控措施为：加强文蛤优良品种保护与选育、加强环境保护、合理控制养殖密度、采取有效消毒措施、加快病原研究,同时应定期进行预警预报。