布鲁氏菌Omp25对胚胎滋养层细胞炎性机制初步研究

论文摘要

目的：布鲁氏菌病（brucellosis）（以下简称布病）是由布鲁氏菌引起的人、畜共患传染病,广泛分布于世界各地。布病对我国经济建设、人民健康生活、国家安全等存在着严重的威胁。布病的病原为布鲁氏菌,是一种胞内寄生菌,它的致病机制以胞内生存为主要特征。胚胎滋养层细胞是布鲁氏菌感染的靶细胞,一旦被破坏,容易引起流产,但是其分子机制目前还不清楚。布鲁氏菌外膜蛋白和Ⅳ型分泌系统家族蛋白与布鲁氏菌的侵染、胞内生存、繁殖有直接关系,是公认的毒力因子。通过探讨毒力因子对感染靶细胞的作用成为研究布鲁氏菌致病机制的分子基础,为探索布病药物作用的候选靶点奠定理论基础。方法：（1）以pET32a为载体,构建了原核表达载体pET32a-omp25,经IPTG诱导在大肠杆菌中得到了表达43.5 KD Omp25融合蛋白,并成功分离纯化蛋白。（2）以真核表达质粒pFGFP为载体,将omp25基因克隆至EGFP基因上游,构建表达Omp25-EGFP融合蛋白的真核表达载体pEGFP-omp25；（3）根据omp25核苷酸序列,分别构建si RNA-a/b/c三个干扰载体,应用脂质体,将pEGFP-omp25分别与siRNAs共转染HPT-8细胞,实时定量PCR筛选最优干扰质粒。（4）以Omp25蛋白的毒力效应及其作用机制为切入点,分别以正相（已纯化Omp25蛋白刺激）和反向（RNAi）分析方法,对Omp25蛋白诱发人胚胎滋养层细胞HPT-8引发的炎性信号分子表达进行了检测。结果：（1）成功构建高效表达载体pET32a-omp25,并分离纯化蛋白；（2）成功构建表达pFGFP-omp25真核质粒和构建针对omp25三个干扰载体,实时定量筛选出了优秀干扰片段,抑制率可达到98%;（3）ELISA检测结果显示NO,LDH活力及上清中炎性相关细胞因子TNF-α随Omp25蛋白浓度成不同程度的上升；（4）实时定量PCR检测结果显示Omp25蛋白使得TLR4和MvD88 mRNA表达量上调。结论：（1）低剂量的Omp255蛋白能够活化胚胎滋养层细胞,可能通过TLR4启动相应免疫应答,产生免疫保护作用。（2）高剂量的Omp25蛋白对于滋养层细胞是有毒性的。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一章 文献综述布鲁氏菌致病机制的研究进展
• 1. 布鲁氏菌的病原学研究
• 2. 布鲁氏菌毒力相关因子
• 2.1 LPS
• 2.2 OMP
• 2.3 应激反应蛋白
• 2.4 BvrR/BvrS
• 2.5 Ⅳ型分泌系统（T4SS）
• 3. 布鲁氏菌的胞内寄生机制
• 3.1 布鲁氏菌侵袭的靶细胞
• 3.2 布鲁氏菌胞内运输及复制
• 4 布鲁氏菌病感染与免疫
• 4.1 天然免疫
• 4.2 获得性免疫
• 第二章 布鲁氏菌外膜蛋白Omp25的原核表达、纯化及免疫原性鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株与质粒
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 实验方法
• 2 结果
• 2.1 omp25目的基因的PCR扩增
• 2.2 pMD18-omp25克隆载体的构建及鉴定
• 2.3 重组表达质粒pET32a-omp25的鉴定
• 2.4 Omp25蛋白在大肠杆菌中的诱导表达表达
• blotting分析'>2.5 Omp25蛋白的纯化和Western_blotting分析
• 3 讨论
• 3.1 外膜蛋白的重要性
• 3.2 关于omp25基因
• 3.3 Omp25蛋白表达问题
• 4 结论
• 第三章 布鲁氏菌外膜蛋omp25的真核表达及干扰片段的筛选
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株、质粒和细胞
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 方法
• 2 结果
• 2.1 omp25基因的PCR扩增
• 2.2 pEGFP-omp25真核表达载体的构建及鉴定
• 2.3 pEGFP-omp25质粒转染HPT-8细胞
• 2.4 Western blot鉴定Omp25蛋白表达
• 2.5 siRNA干扰载体的构建
• 2.6 siRNA干扰载体转染HPT-8细胞
• 2.7 实时定量PCR目的片段的克隆
• 2.8 荧光定量PCR标准曲线制作
• 2.9 omp25基因的干扰效果检测
• 3 讨论
• 3.1 研究omp25基因与流产关系的意义
• 3.2 RNA干扰的探讨
• 4 结论
• 第四章 Omp25蛋白对胚胎滋养层细胞功能的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 细胞、蛋白和质粒
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 方法
• 1.4.1 Bradford法测定Omp25蛋白浓度
• 1.4.2 细胞培养
• 1.4.3 Omp25蛋白对HPT-8细胞培养上清液NO、LDH、TNF-α水平的影响
• 1.4.4 质粒pEGFP-omp25与siRNA-c共转染
• 1.4.5 检测NO、TNF-a水平
• 1.4.6 实时定量PCR检测TLR4和MyD88mRNA的表达变化
• 2 结果
• 2.1 NO、LDH和TNF-a标准曲线的制作
• 2.2 低剂量Omp25对HPT-8细胞上清液NO和LDH活力的影响
• 2.3 高剂量Omp25对HPT-8细胞上清液NO和LDH活力的影响
• 2.4 siRNA-c对HPT-8细胞N0、TNF-α释放量的影响
• 2.5 实时定量PCR检测TLR4、MyD88 mRNA的变化
• 2.6 siRNA-c对转染的HPT-8细胞TLR-4水平的影响
• 3 讨论
• 3.1 布鲁氏菌感染与宿主细胞受体的关系
• 3.2 Toll受体与布鲁氏菌感染
• 4 结论
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 导师评阅表