论文摘要
目的：苯妥英钠（phenytoin，PHT）临床上一直以系统治疗癫痫类疾病、心律不齐以及神经系统性疾病为主，且疗效肯定。直到Shapiro于1958年首次将苯妥英钠用于创伤愈合，并且取得积极的效果，其在创伤方面的疗效及用药方式才得到学者们的关注。目前，已有研究表明苯妥英钠局部用药可用于治疗褥疮性溃疡、静脉淤积性溃疡、糖尿病性溃疡、创伤、烧伤以及麻风营养不良性溃疡等。并且也有研究表明，苯妥英纳对动物成骨细胞、巨噬细胞及人正常牙龈成纤维细胞等的增殖和分化有促进作用。因此，我们一定程度上可推理出苯妥英钠用于牙周组织再生的可能性。牙周韧带细胞（human periodontal ligament cells，hPDLCs）作为牙周组织中的主要功能细胞，具有多向分化潜能，在创伤修复和组织再生中发挥重要作用。本研究在体外培养人牙周韧带细胞的基础上，观察不同浓度苯妥英钠对牙周韧带细胞生物学活性的影响，并探讨其用于促进牙周组织再生的可能性，为进一步研究牙周组织再生提供一种新的药物治疗方法以及为后期体内动物实验提供一定的理论依据。方法：牙周韧带细胞来自因正畸需要而拔出的健康前磨牙，将组织块放入DMEM培养基中培养，达汇合点后细胞传代，第3～5代细胞用于实验。1．将牙周韧带细胞以2×104个／ml接种于96孔板中，24小时后分别加入苯妥英钠（0，1，5，20，100，500，2500μg／ml），与细胞共同孵育3～4天后，用MTT法测增殖活性，用PNPP法测ALP的活性，用考马斯亮蓝法测定细胞总蛋白含量。2．将牙周韧带细胞以5×104个／ml接种于24孔板中，24小时后加入矿化液(含15％FBS、10mmol／Lβ-甘油磷酸钠、10-4mmol／L地塞米松、50mg／L抗坏血酸的DMEM培养液)不同浓度的苯妥英钠（分别为0，20，100，500μg/ml），共同孵育28天后，用Von Kossa法测细胞矿化形成的能力。3．将牙周韧带细胞以1×106个／ml接种于6孔板中，24小时后加入药物（20、100μg／ml3的苯妥英钠液），共同孵育24小时后，裂解牙周韧带细胞，低温离心取上清，用ELISA法测BMP-2的含量。结果：1．在1～100μg／ml药物浓度范围内，细胞呈现典型的梭形或纺锤形外观。在20～100μg／ml的浓度范围内，苯妥英钠对hPDLCs的增殖表现出显著的促进作用（P＜0.01）。至500μg／ml时苯妥英钠的增殖效应开始下降，且与100μg／ml浓度组相比增殖效应显著下降（P＜0.01）。在2500μg／ml时则出现明显的细胞毒性，抑制细胞增殖（P＜0.01）。苯妥英钠在20μg／ml时即开始显著增强ALP的活性（P＜0.01），至100μg／ml时，药物达到最大的效应浓度（P＜0.01）。至2500μg／ml时对ALP活性具显著抑制作用。在＜100μg／ml浓度时，苯妥英钠浓度依赖性增加hPDLCs的蛋白合成，至100μg／ml时，药物达到最大的促蛋白合成能力（P＜0.05）。苯妥英钠在500μg／ml时，蛋白合成能力开始下降，但与100μg／ml浓度组无显著性差异。至2500μg／ml时，伴随苯妥英钠对细胞毒性作用的发挥，与其它所有实验组及对照组相比，蛋白合成受到显著抑制（P＜0.01）。2．共同孵育28天后，四组之间矿化率有显著性差异（P＜0.05），而浓度100μg／ml时，药物具有最大的促矿化作用（P＜0.01）。在500μg／ml时，药物作用开始下降，与100μg／ml浓度组相比显著下降（P＜0.01）。3．与对照组相比，在浓度20μg／ml和100μg／ml时，苯妥英钠能显著促进PDLCs中BMP-2的表达（分别为P＜0.05，P＜0.01）。结论：苯妥英钠在一定浓度范围内（20～100μg／ml）可提高牙周韧带细胞的增殖活性、ALP活性、总蛋白合成、矿化能力及促进BMP-2的合成。可见，适当浓度的苯妥英钠对hPDLCs的增殖和分化有促进作用，并且可以推测苯妥英钠能促进牙周新附着的形成，有利于牙周创伤的愈合和组织再生。但过高浓度的苯妥英钠具有细胞毒性，不利于牙周组织的修复和再生。