多壁碳纳米管致大鼠肺损伤研究

论文摘要

碳纳米管是现今全球消费量最大的纳米材料之一。因其具有强度高、吸收能力强、热稳定性好和电磁学性能优异等多种特性,现已应用在生物医药领域,可用于疾病诊断、辅助成像和药物传输。碳纳米管根据其结构不同分为:多壁碳纳米管（multi-wall carbon nanotubes,MWCNTs）和单壁碳纳米管（single-wall carbonnanotubes,SWCNTs）。碳纳米管质量轻,可在空气中传播,尤其可以在肺部沉积,已有的研究结果提示物质在纳米尺度可能比在常规尺度下表现出更大的毒性。因此,碳纳米管的呼吸毒性引起人们广泛的关注。目前国内外的研究多集中于SWCNTs的健康效应,对MWCNTs的研究较少。鉴于MWCNTs和SWCNTs理化性质不同,可能导致机体健康效应的差异。因此有必要对MWCNTs的环境和生物安全性进行研究,为相关卫生标准的制定提供科学依据,为人群的健康防护奠定基础。本课题以已知成份和粒径大小的MWCNTs为研究对象,采用体外培养的巨噬细胞和肺泡Ⅱ型上皮细胞研究MWCNTS的细胞毒性和氧化损伤作用,并采用整体动物气管滴注染毒研究MWCNTS致肺损伤作用,及所致肺损伤的时间效应。第一部分为体外实验,研究MWCNTs对巨噬细胞和肺泡Ⅱ型上皮细胞的细胞毒性及氧化损伤作用。本次实验将小鼠巨噬细胞株（RAW264.7）和人肺泡Ⅱ型上皮细胞暴露于2.5、10、25、100μg/ml的MWCNTs混悬液,染毒24h后,采用MTT法测定细胞存活率、用化学测定法检测细胞培养上清液中的总蛋白（TP）、乳酸脱氢酶（LDH）和一氧化氮（NO）水平,并测定细胞内谷胱甘肽（GSH）、超氧化物岐化酶（SOD）和丙二醛（MDA）等细胞毒性及氧化损伤指标。用鲁米诺诱导的化学发光法测定细胞内氧自由基水平,并分别测定了染毒后RAW264.7细胞的吞噬能力和A549细胞产生活性氧族的情况。RAW264.7细胞和A549细胞在染毒24h后细胞形态发生改变。随着染毒浓度的上升,两种细胞存活率下降,并存在剂量依赖关系。在相同染毒浓度下,RAW264.7细胞的存活率比A549细胞高。细胞培养上清液中TP、LDH和NO的释放水平随着染毒浓度的增高而逐渐增加,各染毒组RAW264.7细胞和A549细胞内的GSH、SOD含量呈降低趋势,MDA含量呈升高趋势,显示出剂量依赖关系。在相同染毒浓度下,A549细胞表现出更严重的细胞毒性反应和氧化损伤情况。此外,在诱导两种细胞的氧自由基活性增加的同时,MWCNTs不但能显著降低巨噬细胞的吞噬功能,其还能诱导A549细胞ROS水平升高,造成RAW264.7细胞和A549细胞抗氧化能力降低,引起氧化损伤,这可能是造成细胞损伤的重要途径之一。第二部分为整体动物实验,研究MWCNTs致肺损伤作用。将12周龄Wistar大鼠192只,雌雄各半,随机分成6组,即生理盐水对照组、DNA钠盐溶剂对照组、超细碳黑组、MWCNTs染毒组（2.0、10.0、20.0mg/ml）。采用气管滴注法染毒,每天染毒一次,连续染毒3d。最后一次染毒结束后24h、7d、28d和90d分四批处死大鼠,收集肺灌洗液,测定灌洗液中总蛋白（TP）、乳酸脱氢酶（LDH）、碱性磷酸酶（AKP）、谷胱甘肽（GSH）、超氧化物岐化酶（SOD）和丙二醛（MDA）等细胞毒性及氧化损伤指标,并观察肺组织病理改变。实验结果表明,灌洗液中TP、LDH、AKP和MDA含量随着染毒浓度的增加而升高,并随着时间的延长而降低;灌洗液中GSH、SOD均有不同程度的降低程度,随着时间的延长有不同程度的升高,呈剂量依赖关系。肺组织病理学检显示各染毒组出现单核细胞浸润和淋巴细胞增生、黏膜损伤和血管出血等炎症性病变,肺泡腔内和肺泡间隔中可见黑色MWCNTs颗粒沉积,并且随着剂量的增加病变程度有加重的趋势。随着时间的延长,各染毒组的病理改变有所缓解。与超细碳黑组相比,染毒量组在7d时肺出现了肉芽肿,随着时间的延长于90d时发展为多中心性肉芽肿,此外,中、高剂量染毒组于90d时肺组织中出现胶原细胞沉积。电镜下可见MWCNTs染毒组出现细胞核膜肿胀、环形线粒体、以及内质网扩张等改变。另外,MWCNTs于28d开始出现肺门淋巴结转移,提示MWCNTs通过呼吸道途径进入体内后,可经肺淋巴系统转移到其他组织器官。总之,实验结果表明MWCNTs可引起肺组织炎症反应和氧化损伤,对大鼠具有肺毒性作用。本次研究采用的MWCNTs（Nanocyl（?）3150）由日本名古屋工业大学提供,其粒径为10nm,纯度＞95%,碳含量＜5%,长度＜1μm。用脱氧核苷酸钠盐（DNA钠盐）提高MWCNTs的分散度,将MWCNTs与DNA钠盐按1:1比例溶于生理盐水中,配制成所需浓度的DNA钠盐-MWCNTs混悬液,降低其聚集。其中DNA钠盐磷含量＜9%,蛋白含量＜5%。可见粒径、比表面积和浓度可能是纳米颗粒物引起氧化应激损伤和炎症反应的重要因素。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 技术路线
• 第一部分 MWCNTs细胞毒性和氧化损伤研究
• 第一节 MWCNTs对巨噬细胞细胞毒性和氧化损伤研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二节 MWCNTs对肺上皮细胞毒性和氧化损伤研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第一部分小结
• 第二部分 MWCNTs致大鼠肺损伤实验研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分小结
• 结语
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 研究生阶段发表论文