论文摘要
目的慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease, COPD）是全球性的疾病,据WHO预测,在各类致死疾病的排名中COPD将从1990年的第6位上升到2020年的第3位。目前COPD发病的原因和机制还未完全阐明,基因遗传背景和诱发因素（包括环境污染,吸烟,年龄,反复气道感染等）的共同作用是目前认为可能的发病机制,其不可逆气流受限也可能与呼吸中枢兴奋性异常有关。哪些因素在COPD发生和发展过程中影响了呼吸中枢的调节异常尚不明了。近来新发现的下丘脑合成的具有重要作用的神经肽—Orexin （OX,食欲素）,除了参与摄食、能量代谢、内分泌、心血管活动、睡眠-觉醒等多种生理功能外,最近还发现其可能参与了对呼吸活动的中枢调节,且在COPD患者中其血浆含量有显著变化。因此本实验利用制作COPD模型大鼠,观察中枢OXA的含量和食欲素1型受体（orexin type 1 receptor, OX1R）和食欲素2型受体（orexin type 2 receptor, OX2R）的表达,并与外周比较,电生理进一步观察在延髓前包钦格复合体（pre-Botzinger complex, PBC）微量注射OX对膈神经放电的效应,探讨OXA对呼吸活动的调节作用。应用中国传统医学所特有的治病手段—针刺疗法,观察其对COPD模型大鼠肺通气功能的影响,检测针刺后OX含量及受体表达的变化,初步评价针刺效应及其与OX的关系。为进一步探讨OX在COPD中对呼吸活动的调节和针刺疗效提供实验依据。方法1.本研究用Sprague-Dawley （SD）大鼠制备COPD模型。利用香烟烟雾对大鼠进行每日两次烟熏,每次一小时,连续烟熏12周后以大鼠肺组织的病理形态学和肺通气功能的改变来评价COPD模型的制备成功与否,并观察模型组大鼠中枢呼吸驱动的变化。2.应用放射免疫方法、荧光定量PCR和免疫组化方法,检测大鼠组织匀浆和血浆中OXA的含量,观察食欲素前体（prepro-orexin,PPO）基因在模型组和对照组下丘脑的表达以及OX受体在延髓和肺的表达,观察大鼠的中枢和肺组织中OXA及受体的表达。3.电生理实验,采用脑立体定位和中枢核团微量注射技术,观察OX、Glutamate （Glu）等不同药物微量注射到PBC时对大鼠膈神经放电活动的效应。4.针刺疗法,选用大鼠肺俞和足三里穴进行电针,每天30分钟,持续两周,用上述方法观察大鼠肺通气功能的变化,测定中枢OXA含量,观察OX及受体的表达。结果1.烟熏12周后COPD模型大鼠与对照组相比,肺泡腔扩张,表面积明显增大,部分肺泡壁融合,肺的小支气管管壁明显增厚,肺动态顺应性降低（P<0.05）,气道阻力增加（P<0.05）,表明肺通气功能下降。潮气量与吸气时间比略有增加,但无统计学差异。2.对两组大鼠的组织匀浆和血浆的放射免疫学分析,结果显示：COPD大鼠下丘脑和延髓OXA的水平显著高于对照组（P<0.01,P<0.001）；而血浆中OXA的水平低于对照组（P<0.05）,肺组织中的OXA水平与对照组相比有下降,但无统计学差异。3.荧光定量PCR的结果显示,PPO基因只表达于大鼠的下丘脑,肺和延髓均无表达。模型组下丘脑的PPO基因表达高于对照组（P<0.05）；OX1R基因在模型组的延髓组织中的表达也高于对照组（P<0.05）,OX2R基因在模型组延髓的表达有所升高,但与对照组比较无统计学意义；OX1R基因在两组肺组织中均不表达；OX2R基因在模型组肺组织的表达比对照组减少,但没有统计学差异。4.免疫组化观察结果显示,OXA免疫反应阳性细胞在两组大鼠的下丘脑外侧核、穹隆周围核呈较集中的表达,而后核和未定带区则为零星分布；COPD大鼠的下丘脑OXA的表达明显高于对照组（P<0.01）；在COPD大鼠肺部OXA免疫反应阳性细胞的表达略见增多,但与对照组相比无统计学差异。对受体的观察结果显示,OX1R表达于延髓腹外侧区的PBC和疑核,OX2R也表达于PBC,疑核未见明显表达；OX1R和OX2R的阳性细胞在舌下神经核均有表达。另外,OX1R和OX2R在脊髓的C3-5段的前角运动细胞区也有表达。图像处理分析发现模型组的OX1R和OX2R的相对光密度在延髓腹外侧的表达显著高于对照组（P<0.01）。5.微量注射OXA和OXB到正常大鼠延髓PBC,结果均可引起膈神经放电强度显著增加（P<0.01,P<0.05）,且OXA的兴奋呼吸效应大于OXB。阻断OX1R,膈神经放电强度明显减弱（P<0.01）。微量注射OXA到COPD模型组延髓PBC,引起膈神经放电强度增加,与对照组相比P<0.01。微量注射Glu到正常大鼠延髓PBC区,同样产生膈神经放电强度增加的效应（P<0.01）,但阻断NMDA受体后,原先OXA使膈神经放电强度增加的效应受到抑制（P<0.05）。而OX1R阻断剂也可抑制Glu使膈神经放电强度增加的效应（P<0.05）。而以上在PBC注射的药物对大鼠的呼吸频率、心率和血压均无明显影响。6.针刺COPD大鼠两周后,大鼠的肺动态顺应性增加,气道阻力降低,表明肺通气功能明显改善（P<0.05）。放免测得下丘脑和延髓中OXA含量虽有下降,但与COPD组相比无统计差异。免疫组化也未见OXA在下丘脑部位有明显改变,但荧光定量PCR结果表明,PPO基因在下丘脑表达有显著下降（P<0.01）。荧光定量PCR和免疫组化实验的结果表明延髓腹外侧区两种受体均在针刺后表达下降,但仅OX2R的基因和蛋白表达下降有统计学差异（P<0.01）。结论1.香烟烟熏能成功制作COPD模型大鼠,符合临床COPD患者的主要病理和肺通气功能下降的特点。2.COPD模型大鼠下丘脑OXA神经元的合成和轴突分泌加速,延髓腹外侧OX受体表达上调,提示OXA可能参与COPD的病理过程,其在中枢的显著增高为其参与中枢对呼吸活动的调节提供了实验证据。3.在大鼠延髓腹外侧PBC核团,内源性OX的释放可维持正常的呼吸兴奋性,外源性OX能明显增加呼吸的强度,且OXA的作用比OXB大。在COPD大鼠,OXA在PBC的呼吸兴奋效应比正常鼠更明显,这与该部位的受体OX1R表达上调有关。4.微量注射Glu到大鼠延髓PBC核团也引起膈神经放电活动的强度增加,其相应受体阻断剂可部分抑制OXA使膈神经放电强度增加的效应,而OX1R阻断剂可部分抑制Glu使膈神经放电强度增加的效应,提示该部位两者的受体之间可能存在相互易化作用。5.针刺COPD大鼠可改善肺通气功能；引起下丘脑OXA的前体基因表达下降以及延髓腹外侧区OX2R基因和蛋白表达下调。提示针刺可能通过OX来调节呼吸活动,进而改善肺通气功能。
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标签：慢性阻塞性肺疾病论文; 呼吸调节论文; 动物模型论文; 针刺疗法论文;