角毛壳菌表达序列标签测定及几丁质酶基因的克隆与表达

论文摘要

角毛壳菌（Chaetomium cupreum Ames）是一种重要的生物防治真菌,对多种植物病原真菌均有很好的防治作用。本文以角毛壳菌（C. cupreum）为研究对象,应用cDNA文库构建、表达序列标签测定（ESTs）、生物信息学分析和转基因技术,研究角毛壳菌（C. cupreum）的生物防治分子机理,为研究和开发新型角毛壳菌（C. cupreum）微生物杀菌剂奠定坚实的基础。利用分别以葡萄糖和几丁质为碳源生长的角毛壳菌（C. cupreum）菌丝体为材料,成功地构建了角毛壳菌（C. cupreum）两个不同培养条件下的cDNA文库,分别命名为菌丝体cDNA文库（简称C1文库）和菌丝体诱导cDNA文库（简称C2文库）。C1文库的滴度为0.93×106 pfu/mL,重组率为94.2%,插入片断平均长度约1.3 kb。C2文库滴度为1.02×106 pfu/mL,重组率为95.3%,插入片断平均长度约1.2 kb。对随机挑选的cDNA克隆进行ESTs测定和生物信息学分析,C1文库共获得3069条高质量ESTs序列,它们代表了1471条单一基因（unigenes）,包括392条重叠群（contigs）和1079条单拷贝基因（singlets）。其中874条单一基因与国际公共非冗余蛋白质数据库蛋白同源,代表已知功能基因,597条为未知功能的新基因。GO分类表明已知基因中与生物学过程（61.75%）相关的功能基因最多,其次是分子生物学功能基因（33.65%）和细胞组分（4.60%）功能基因。C2文库共获得1221条ESTs序列,拼接为828条单一基因,包括176条重叠群,652条单拷贝基因;468条为已知功能基因,360条为未知功能新基因。已知基因中也是与生物学过程相关的功能基因所占比例最高（63.31%）,其次是分子生物学功能基因（33.77%）和细胞组分功能基因（2.92%）。C1和C2文库所获得的ESTs序列登录在国际GenBank数据库中,序列接受号为DV544375-DV548659。对C1和C2文库进行了基因表达差异分析。在两个文库中共同表达的基因是333条,C1文库中特异表达基因是1138条,C2文库中特异表达基因是495条,其中包括11条与生物防治相关的基因。对C1和C2文库进行了代谢途径差异分析。共发现角毛壳菌（C. cupreum）70种代谢途径,其中C1文库中包括67种代谢,C2文库中包括63种代谢。分析表明,角毛壳菌（C. cupreum）在与植物病原真菌斗争过程中,通过启动糖异生作用等代谢来提高自身的生长速度,以争取更多的营养和生存空间与植物病原真菌竞争。C1文库中得到20条与生物防治相关的基因,C2文库中得到23条与生物防治相关的基因,研究发现,角毛壳菌（C. cupreum）的生物防治作用是多机制协同作用的复杂体系,主要涉及细胞壁降解作用、蛋白酶水解作用、拮抗作用等。两个文库获得的生物防治基因不同。C2文库中独有的与生物防治相关表达基因主要是PTR2转运蛋白（DV547977）、β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶（DV545166）、α-葡萄糖苷酶（DV548040）、ABC转运蛋白（DV546007）。克隆了角毛壳菌（C. cupreum）46kDa内切几丁质酶基因（Chi46,序列登录号EUI42805）,利用构建的pYES2-Chi46酵母表达载体,将Chi46基因成功转化到酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）H158菌株。对转化子发酵条件进行优化,结果表明:当半乳糖诱导浓度为2.5%、几丁质浓度为0.4%、诱导培养基的起始pH值为6时,可较大幅度地提高转化子几丁质酶酶活,最高可达1.96U。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 课题的学术背景及其理论与实际意义
• 1.2 国内外文献综述
• 1.2.1 微生物农药的研究概况
• 1.2.2 毛壳菌的研究概况
• 1.2.3 cDNA文库的构建
• 1.2.4 表达序列标签研究进展
• 1.2.5 生物信息学与ESTs序列分析
• 1.2.6 微生物几丁质酶的研究概况
• 1.2.7 酿酒酵母表达研究概况
• 1.3 目前角毛壳菌研究中存在的问题
• 1.4 课题来源及主要研究内容
• 1.4.1 课题来源
• 1.4.2 主要研究内容
• 第2章 实验材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 酶和试剂
• 2.1.4 仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 角毛壳菌的培养
• 2.2.2 角毛壳菌产几丁质酶的研究
• 2.2.3 角毛壳菌两个菌丝体cDNA文库的构建
• 2.2.4 角毛壳菌表达序列标签测定
• 2.2.5 ESTs序列的生物信息学分析
• 2.2.6 角毛壳菌两条几丁质酶基因的表达类型鉴定
• 2.2.7 内切几丁质酶基因Chi46 的克隆
• 2.2.8 几丁质酶基因Chi46 在酿酒酵母中的表达
• 2.2.9 转化子几丁质酶诱导表达及发酵条件的优化
• 第3章 C1文库和C2 文库的构建及质量鉴定
• 3.1 角毛壳菌产几丁质酶的研究
• 3.2 角毛壳菌两个菌丝体 cDNA 文库的构建
• 3.2.1 总RNA的分离提取
• 3.2.2 mRNA的提取纯化
• 3.2.3 cDNA双链的合成
• 3.2.4 cDNA片断的胶回收及和载体的连接
• 3.2.5 cDNA文库的PCR鉴定
• 3.3 cDNA 文库的质量鉴定
• 3.4 角毛壳菌cDNA文库构建和质量鉴定的讨论
• 3.4.1 总RNA的提取纯化
• 3.4.2 构建cDNA文库取材时间的选择
• 3.4.3 cDNA文库构建中逆转录酶的选择
• 3.4.4 构建 cDNA 文库中 cDNA 片断和载体的选择原则
• 3.4.5 检测cDNA文库插入片断长度方法的选择
• 3.4.6 cDNA文库质量的评估
• 3.5 本章小结
• 第4章 角毛壳菌基因表达谱的建立
• 4.1 C1 文库的大规模ESTs测序分析
• 4.1.1 C1 文库的大规模ESTs测序结果
• 4.1.2 C1 文库ESTs序列的长度分析
• 4.1.3 C1 文库ESTs序列的聚类分析
• 4.1.4 C1 文库中基因表达谱的分析
• 4.1.5 C1 文库中ESTs序列的GO分类
• 4.1.6 C1 文库获得的可能与生物防治相关的基因
• 4.2 C2 文库的大规模ESTs测序分析
• 4.2.1 C2 文库的ESTs测序结果
• 4.2.2 C2 文库ESTs序列的聚类分析
• 4.2.3 C2 文库中基因表达谱分析
• 4.2.4 C2 文库的ESTs序列GO分类
• 4.2.5 诱导条件下获得的可能与生物防治相关的基因
• 4.3 ESTs序列在网上的公布与提交
• 4.4 角毛壳菌ESTs序列分析和生物防治机制的讨论
• 4.4.1 ESTs序列测定和生物信息学分析
• 4.4.2 关于角毛壳菌生物防治机制的探讨
• 4.5 本章小结
• 第5章 C1 文库和 C2 文库的比较分析
• 5.1 两个cDNA文库单一基因的比较
• 5.2 两个cDNA文库基因表达丰度差异
• 5.3 两个cDNA文库GO功能分类比较
• 5.4 两个cDNA文库代谢途径的差异比较
• 5.5 两个cDNA文库生物防治相关基因比较
• 5.6 角毛壳菌两条几丁质酶基因的比较分析
• 5.6.1 两条几丁质酶基因的生物信息学比较
• 5.6.2 两条几丁质酶表达类型的RT-PCR鉴定
• 5.7 角毛壳菌两个cDNA文库比较的分析
• 5.7.1 高表达基因的比较分析
• 5.7.2 代谢途径的比较分析
• 5.7.3 生物防治相关基因的差异分析
• 5.7.4 两条几丁质酶基因表达的分析
• 5.7.5 关于几丁质酶代谢调控的讨论
• 5.7.6 差减cDNA文库和一般cDNA文库的比较
• 5.8 本章小结
• 第6章 角毛壳菌几丁质酶基因的克隆及表达
• 6.1 内切几丁质酶基因序列的克隆
• 6.2 内切几丁质酶基因Chi46 保守区分析
• 6.3 几丁质酶基因Chi46 的酿酒酵母转化表达
• 6.3.1 几丁质酶基因Chi46 的扩增及与pYES2 载体的连接
• 6.3.2 几丁质酶基因Chi46 的酿酒酵母转化和鉴定
• 6.4 转化子产几丁质酶发酵条件的优化
• 6.4.1 培养时间对转化子产几丁质酶的影响
• 6.4.2 半乳糖浓度对转化子产几丁质酶的影响
• 6.4.3 几丁质浓度对转化子产几丁质酶的影响
• 6.4.4 诱导培养基的起始pH值对转化子产几丁质酶的影响
• 6.5 Chi46 基因克隆和在酿酒酵母中表达的讨论
• 6.5.1 几丁质酶基因Chi46 的扩增
• 6.5.2 几丁质酶基因Chi46 在酿酒酵母中的表达
• 6.5.3 转化子发酵条件优化的研究
• 6.6 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢
• 个人简历