论文摘要
肝癌是人体常见的致命性肿瘤，预后差，严重威胁人类的健康，因此深入研究肝癌的发生发展机制，进而加强肝癌的防治具有重要意义。随着分子生物学的发展，已逐渐认识到表遗传学（Epigenetics）调节与肿瘤基因的转录调控密切相关；因为这种表遗传学调节不改变基因编码序列，并且是可逆的，因而越来越受到重视。研究表明，表遗传学或／和遗传学改变均可引起肿瘤的发生是一个涉及多种肿瘤基因功能改变的多步骤过程，其中肿瘤抑制基因的功能失活为细胞的恶性转化所必需。由DNMTs催化完成的DNA甲基化是DNA的一种天然修饰方式，是表遗传学主要内容之一，其在基因的表达调控、胚胎发育调节、基因组印记、X染色体失活及肿瘤的发生等许多方面发挥着重要的作用。在DNMTs家族中，DNMT3b的作用最为重要。DNMT3b主要表达于未分化的胚胎干细胞，催化DNA的从头甲基化，在正常体细胞中表达很低。CPG岛是公认的基因表达调控区域。大约50％的CPG岛位于基因启动子区域。在正常细胞大部分的启动子区域CPG岛是未甲基化的。由DNMT3b催化的肿瘤抑制基因启动子区CPG岛的甲基化反应，使CPG岛甲基化状态改变导致该基因表达沉默，进而引起肿瘤的发生。我们的研究也发现，在肝细胞恶性转化过程中，FHIT基因（一重要的肿瘤抑制基因）的表达明显受抑制，用siRNA抑制DNMT3b表达后，FHIT基因又恢复表达，但这一过程中，FHIT基因启动子区域CpG岛并未被甲基化，由此提示在肝细胞恶性转化过程中DNMT3b除发挥DNA甲基转移酶作用外尚有转录调控因子的作用。事实上，DNMT3b具有PWWP和PHD结构域，而这些结构域与蛋白质-蛋白质间的相互作用有关，说明DNMT3b已经具备了作为信号传导分子的基础。以前的研究多集中于DNMT3b作为酶的功能，而其作为转录调控因子的功能目前尚未见报道。信号转导子和转录激活子（Signal transducers and activators of transcription，STATs）是一重要的核转录因子．STATs家族成员参与了许多细胞因子、生长因子的信号传导，在调节人体免疫反应、炎症反应和细胞的生长、分化、凋亡等方面发挥着重要作用，与人类恶性肿瘤的发生、发展和演进有关。据文献报道，STATs及其下游基因Bcl-2、CyclinD1、c-myc、VEGF、P21等在肝癌组织中异常表达，而STATs在肿瘤的发生发展中，启动子区甲基化状态不变。有研究表明：STATs及其下游基因在肿瘤的发生、发展过程中起到重要作用。如：Bcl-2、CyclinD1、c-myc、VEGF都是重要的癌基因。它们在肝细胞肝癌的发生、增殖、分化、凋亡、血管生成和侵袭转移等多方面都发挥了重要作用。如果能够证实DNMT3b与STATs信号传导通路相关联，则提示DNMT3b-STATs信号传导通路的存在，这就说明DNMT3b即可以作为DNA甲基转移酶催化基因的甲基化，影响基因的表达，又可以作为转录调控因子发挥作用。这就进一步揭示了DNMT3b功能的多样性，为肿瘤的基因治疗提供新的靶点，为肝癌的防治提供新思路。方法1、传代培养SMMC7721细胞；2、将终浓度为50nM的DNMT3bsiRNA转染到肝癌细胞SMMC7721中：3、在SMMC7721细胞转染DNMT3bsiRNA 48h后，收集转染细胞和未转染细胞提取细胞质蛋白或总蛋白，用Western blotting检测DNMT3b的表达改变；4、在SMMC7721细胞转染DNMT3bsiRNA前及转染24、48h后，用细胞计数板计数转染细胞和未转染细胞的细胞数量；5、用Western blotting检测STATs及其下游基因c-myc，VEGF，CyclinD1等的表达改变情况；6、处理所得数据，得出结论。结果1、在SMMC7721细胞转染DNMT3bsiRNA 48h后，通过Western Blotting检测DNMT3b的表达发现：转染细胞的DNMT3b表达水平比未转染细胞明显降低。2、转染细胞的生长速度与未转染细胞相比明显受到抑制，统计学上有显著性差异（P＜0.05），同时有大量死亡细胞存在。3、转染细胞的STAT1、STAT3、STAT5及其下游基因VEGF、c-myc、CyclinD1的表达水平与未转染细胞相比均降低。结论1、DNMT3bsiRNA的建立可以方便地研究DNMT3b的功能。通过DNMT3bsiRNA特异性的抑制DNMT3b的表达。2、在SMMC7721细胞体系中存在DNMT3b-STATs信号传导通路，抑制DNMT3b的表达可以同时下调STAT1、STAT3、STAT5及其下游基因VEGF、c-myc、CyclinD1等的表达。3、DNMT3b的表达改变，可以引起细胞周期蛋白CyclinD1的表达改变，使肿瘤细胞停滞在G1期，抑制肝癌细胞的增殖，促进细胞的凋亡。