论文摘要
[目的意义]高致病性禽流感（highly pathogenic avian influenza,HPAI）（H5N1）病毒在亚洲造成成千上万的禽类死亡,并且疫情已经波及到中东地区、欧洲和非洲50多个国家。HPAI H5N1已经跨越种属障碍,感染人类和其他哺乳动物。据WHO统计截至2008年4月3日全球共确诊378名病例,238人死亡,病死率高达60%以上。几起禽流感病毒可能人间传播的报道更加深了人们对流感世界大流行的恐慌。全球报道的HPAI（H5N1）病例主要症状表现为严重的肺炎,并快速发展为急性呼吸系统衰竭甚至死亡。除了临床症状明显的H5N1病例外,是否存在该病毒的隐性感染病例?在确诊的H5N1病例中,的确有少部分病例表现为非典型的禽流感症状,呼吸道症状不明显,最终通过实验室诊断而确诊。1997年香港H5N1禽流感（HongKong Flu）期间,对H5N1确诊病例的密切接触者和禽类工作者开展的血清流行病调查显示有部分调查对象H5N1禽流感病毒抗体反应阳性。随着H5N1病毒的不断进化,目前流行的禽流感病毒（clade1,2）已经与1997年H5N1禽流感病毒（clade 0）分属于不同的分支,基因序列和抗原性表现出较大的差异。由此,目前流行的HPAI（H5N1）可能存在隐性感染,也可能仅出现严重临床表现的感染病例。依靠被动监测和病例上报很难发现隐性感染病例,需要通过主动监测和开展流行病学调查才能达到上述目的。高致病性禽流感作为一种新发传染病,其检测技术尤其是血清学检测方法还不完善。血凝抑制试验（hemagglutination inhition,HI）及微量中和试验（microneutralization,MN）是流感病毒血清学诊断的常用方法。然而在禽流感病毒血清学检测时存在敏感度、可行性和大样本量可操作性上的局限性,需要改进后为应对人间禽流感流行做好技术准备。另外,在流感病毒的免疫防御机制中,针对流感病毒表面蛋白的中和抗体具有重要保护作用,然而由于血凝素（hemagglutinin,HA）和神经氨酸酶（neuraminidase,NA）经常发生变异,使流感病毒逃逸宿主的体液免疫。事实上,针对病毒的T淋巴细胞,在缺乏体液免疫时,可以为机体提供具有保护意义的反应。尤其是释放IFN-γ的T细胞（IFN-γ+T细胞）介导的免疫应答在清除流感病毒感染中有非常重要的作用。本研究的核心目的是通过建立并应用更适合禽流感病毒检测的血清学方法和细胞免疫学方法,探索是否存在HPAI H5N1人间隐性感染。[内容方法]本研究将实施较大规模的血清流行病学调查,调查对象涉及我国不同地域,不同禽类暴露水平的健康人群和出现流感样症状的高危人群。应用改进的禽流感病毒血清学检测技术（HI,MN）及联合应用其他常见的血清学检测方法（enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA和Western blot,WB）从机体体液免疫角度提供实验室证据。另外,采用酶联免疫斑点检测试验（enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT）尝试从禽流感病毒特异性细胞免疫水平更深入地探讨人群中禽流感病毒特异性免疫应答反应。[研究结果]本研究通过流式细胞分拣技术筛选到富含唾液酸α（2,3）半乳糖受体的马红血球代替该受体相对较少的鸡血球用于HI试验。通过免疫动物和健康人血清均证实马血球HI比鸡血球HI检测禽流感血清抗体的敏感度提高,特异度良好,可以区分抗原性不同的禽流感病毒免疫后抗体水平差异。另外,醛化处理马血球可以解决新鲜血球不易保存,不易获得等可实用性难题。比较甲醛、戊二醛醛化血球与新鲜马血球HI试验后认为,戊二醛醛化血球显示出更稳定的实验结果,可以替代新鲜马血球用于HI,加入甘油后使用期限延长。本研究建立的结合感染细胞的快速MN试验与传统观察细胞病变（cytopathogenic effect,CPE）的MN相比较,中和抗体检测结果一致性良好,但缩短了检测时间,可以一次测定大量血清样品,并完成商品化所需前期数据。本课题的核心结果是高致病性禽流感病毒（H5N1）的血清流行病学调查,本次调查共涉及四类调查对象:1)H5N1禽流感疫情暴发地长期居住的一般健康人群（新疆,辽宁）;2)H5N1禽流感感染高危人群（新疆,山东）;3)流感季节流感样症状病人（安徽,北京）;4)无禽流感疫情暴发地长期居住的一般健康人群（山西）。其中禽流感疫情暴发地暴发时间距调查时间分别为1年（新疆）和3年（辽宁）,暴发类型均为禽间人间病例同时存在。山东地区的H5N1禽流感感染高危人群来自几家大型的禽类相关加工厂工作人员。流感季节流感样症状病人分别为集中（安徽）和散发（北京）病例。全部调查对象共计1825人。调查对象基本人口学特征分布较均一。通过采用新建立的和联合其他多种血清学检测方法,采用不同的H5N1病毒株检测以及通过回访调查,结果显示新疆禽流感疫情暴发地长期居住的一般健康人群中可能存在隐性感染病例。ELISPOT细胞免疫检测发现,禽流感病毒HA肽段（包括H5,H7,H9亚型）在人群中均有一定比例的IFN-γ+T细胞应答阳性反应,然而人流感病毒与禽流感病毒在T细胞免疫水平的交叉现象给禽流感特异性T细胞免疫反应的分析带来困难,但是有可能存在H5亚型禽流感特异性T细胞免疫反应,需要进一步通过单个肽段的ELISPOT试验验证。然而已鉴定出有H7和H9亚型禽流感病毒特异性识别的肽库,而且其中部分调查对象的相应血凝素血清抗体也为阳性。另外,季节性流感病毒T细胞免疫应答随着年龄升高而降低,其中保守肽库（NP,M,NS,PO）诱导T细胞反应随着年龄升高而逐渐降低,而两个变异较快的肽库（HA,NA）在三组人群中（20-44岁,45-59岁,大于等于60岁）诱导的T细胞水平呈现“∧”和“∨”型的折线变化。流感抗体水平（包括禽流感H5,H7,H9亚型和人流感H3亚型）与IFN-γ+T细胞阳性应答反应（ELISPOT检测结果）间无相关性。[研究结论]改进的禽流感病毒血清学检测方法具有实用价值,通过进一步优化条件,以期形成商品后可以在基层疾病预防控制部门中推广。根据本研究现有结果,认为存在高致病性禽流感（H5N1）隐性感染者,但是感染人数很低。高致病性禽流感（H5N1）隐性感染的存在关系到正确评估该病死亡率,采取适宜的监测方案发现隐性感染者和制定相应预防控制措施应对流感大流行。研究这一方向不仅对我国而且对世界禽流感防控工作都有重大意义,亟需进一步加强流行病学调查和监测,预防和控制流感世界大流行。本课题为禽流感病毒细胞免疫研究提供了宝贵的经验,需要更多的研究探讨禽流感病毒（H5N1）特异性T细胞免疫应答,及其年龄相关的抗体反应与细胞免疫应答反应,为开发流感疫苗提供有益的数据支持。围绕明确的研究目的,本课题的研究角度覆盖禽流感病毒体液和细胞两大免疫反应,对禽流感血清抗体检测有所技术突破,对研究禽流感病毒感染有重要的科学意义以及为制定流感大流行防控措施提供了基础理论数据。