野油菜黄单胞菌锌吸收调控蛋白的鉴定

论文摘要

锌吸收调控蛋白（Zinc uptake regulator, Zur）是一个金属调控蛋白,在许多细菌中负调控高亲和性的锌吸收系统。当细胞内锌离子浓度过高时,Zur被激活并阻碍高亲和性锌吸收系统对锌的吸收,避免过量的锌对细菌产生毒性。在Xcc8004基因组中没有注释zur基因,用大肠杆菌的Zur蛋白序列比对Xcc8004基因组,发现编号为XC1430的ORF（原来注释为Fur family transcriptional regulator）编码的蛋白与大肠杆菌的Zur蛋白有42%的相似性。通过整合突变的方法构建了XC1430的突变体NK1430。NK1430在含400μM Zn2+的丰富培养基和含110μM Zn2+的基本培养基不能生长,而野生型8004和互补菌CNK1430则能正常生长。在含300μM Zn2+的丰富培养基中,NK1430菌体积累的锌为4.21μg/1010个细胞,而8004和CNK1430分别只有1.67和1.83μg/1010个细胞。这表明XC1430编码的产物是锌吸收调控蛋白。为了确定XC1430与Xcc致病的关系,对NK1430进行了致病性实验。用剪叶接种法以OD600=0.1的菌液浓度接种寄主满身红萝卜（Raphanus sativus L. var. radiculus Pers.）,结果发现接种10天后Zur突变体NK1430引起的平均病斑长度为3.1mm,而8004和CNK1430的引起平均病斑长度分别为13.3mm和13.2mm,表明Zur是Xcc致病所必需的。HR反应检测结果显示NK1430在辣椒叶上引

论文目录

• 第一章 前言
• 1.1 野油菜黄单胞菌（XANTHOMONAS CAMPESTRIS）概况
• 1.1.1 野油菜黄单胞菌简介
• 1.1.2 野油菜黄单胞菌一些重要的致病因子和致病相关基因
• 1.2 细菌的锌代谢平衡机制
• 1.2.1 细菌的锌离子转运系统
• 1.2.2 锌吸收调控蛋白
• 1.3 本工作的目的与内容
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 本实验所用的菌株和质粒见表
• 2.1.2 培养基及生长条件
• 2.1.3 抗生素及其贮存、使用浓度
• 2.1.4 溶液与缓冲液
• 2.2 方法
• 2.2.1 常规PCR反应
• 2.2.2 反转录PCR
• 2.2.3 琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.4 PCR产物的回收与纯化
• 2.2.5 质粒的提取
• 2.2.6 总DNA的提取
• 2.2.7 总RNA的提取
• 2.2.8 限制性内切酶酶切
• 2.2.9 DNA连接
• 2.2.10 电脉冲感受态细胞的制备
• 2.2.11 转化
• 2.2.12 三亲本接合
• 2.2.13 Xcc 8004基因组上目标基因的整合突变体的构建
• 2.2.14 胞外多糖的检测
• 2.2.15 胞外酶的检测
• 2.2.16 植株的致病性试验
• 2.2.17过敏性反应
• 2.2.18 细菌在寄主中的生长繁殖的测定
• 2.2.19 锌敏感性实验
• 2.2.20 菌体内的锌含量测定
• 2.2.21 GUS（β-葡糖苷酸酶）活性检测
• 第三章 结果与分析
• 3.1 野油菜黄单胞菌中存在与大肠杆菌ZUR基因同源的基因
• 3.2 XC1430突变体的构建
• 3.2.1 XC1430内部片段的PCR扩增
• 3.2.2 将内部片段克隆到载体pK18mob上
• 3.2.3 突变体的筛选及验证
• 3.3 XC1430突变体互补菌的构建
• 3.3.1 XC1430全基因的扩增
• 3.3.2 将XC1430全基因克隆到载体pLAFR6上
• 3.3.3 互补菌的获得
• 3.4 突变体的生长特性
• 3.4.1 突变体在完全培养基中的生长测定
• 3.4.2 突变体在基本培养基中的生长测定
• 3.5 XC1430编码的产物是锌吸收调控蛋白
• 3.5.1 突变体在不同锌浓度下的生长
• 3.5.2 菌体内的锌含量测定
• 3.6 XC1430与黄单胞菌致病相关
• 3.7 XC1430是黄单胞菌在叶内生长必需的
• 3.8 突变体的过敏性（HR）反应
• 3.9 XC1430与EPS产量相关
• 3.9.1 突变体的胞外蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶检测
• 3.9.2 突变体的EPS产量测定
• 3.9.3 XC1430不调控已知的EPS合成相关基因
• 3.10 XC1430与XC1429分别属于不同的转录子
• 3.11 XC1430可能存在两个不同的启动子
• 3.11.1 不同长度片断互补菌的构建
• 3.11.2 不同长度片段互补菌的锌敏感性检测
• 3.11.3 不同长度片段互补菌的EPS产量测定
• 3.11.4 不同长度片段互补菌的致病性检测
• 第四章 讨论
• 4.1 XC1430编码锌吸收调控蛋白
• 4.2 XC1430与致病性相关
• 4.3 XC1430的转录
• 参考文献
• 致谢
• 研究生阶段论文发表情况