新麦草多倍体诱导及细胞学研究

论文摘要

新麦草（Psathyrostachys juncea （Fisch.） Nevski）是小麦族中少有的二倍体物种,因其低倍性,适宜用染色体加倍方法进行遗传改良。研究旨在利用离体组织培养并诱导同源四倍体对新麦草进行染色体加倍。首先以2品种新麦草为材料,建立新麦草高效再生体系。分别以幼穗、幼胚和成熟胚为外植体。结果表明,1～3cm幼嫩穗、授粉后14～17d长度为1mm的幼胚最适于愈伤诱导,但2品种有一定差异。幼胚需4℃预处理1～5d,成熟胚需10℃下浸泡48h。2,4-D在愈伤组织诱导阶段作用最显著。大于4cm幼穗和成熟胚需添加0.3～0.5 mg/LABA抑制花器官分化和胚萌发。CH可促进愈伤组织生长,但对外植体细胞分化方向没有决定作用。胚性愈伤容易分化和再生,而非胚性愈伤在添加低浓度2,4-D和6-BA的培养基上经2次以上继代改造可部分转化为胚性愈伤。愈伤组织分化再生过程中NAA和6-BA均起重要作用,胚性愈伤分化率均达80%以上。建立新麦草高效再生体系的关键步骤是外植体筛选、诱导愈伤组织形成和胚性愈伤组织的改造。用秋水仙素处理新麦草萌动种子、分蘖芽和愈伤组织诱导染色体加倍,处理后的植株用根尖压片法进行染色体倍性鉴定。结果表明,在30℃下,用1500mg/L秋水仙素和1.5%DMSO处理4h诱导萌动种子获得了混倍体植株,平均2n=28细胞突变率为24.4%;以500 mg/L秋水仙素和1.5%DMSO在25℃处理幼苗分蘖芽48h加倍诱导率更高,四倍体细胞平均比例为42.65%,此外还发现突变为单倍体、三倍体、非整倍体的细胞,总比例为8.88%;以100mg/L秋水仙素和1.5%DMSO、在25℃处理72h诱导愈伤组织加倍效率最高,平均四倍体细胞比例为53.58%,并得到8株四倍体细胞在80%以上材料。Pendimethalin处理后的愈伤组织没有得到再生植株。形态比较和气孔保卫细胞观察表明,新麦草加倍植株叶片长、宽均较二倍体有所增加。四倍体叶片气孔保卫细胞长度比二倍体增加13.52%,差异显著。气孔之间距离显著增大。比较诱导形成的同源四倍体新麦草光合作用和叶绿素荧光动力学。测定结果用直线回归和Farquhar模型进行拟合。结果表明,四倍体光补偿点、光饱和点、最大净光合速率高于二倍体,气孔导度值整体低于二倍体,表明四倍体对强光的适应性好于二倍体。四倍体CO2补偿点、CO2饱和点、最大羧化速率、最大电子传递速率和最大磷酸丙糖利用速率也显著高于二倍体,表明四倍体在高光强和高CO2浓度下比二倍体具有更大的光合潜力。叶绿素荧光观测结果表明,四倍体原初光能转化效率高于二倍体,干旱胁迫下四倍体PSⅡ实际光化学效率、光化学淬灭系数qP和非光化学淬灭系数qN低于二倍体,说明干旱胁迫下二倍体的光保护机制作用更明显。统计2个二倍体品种新麦草根尖细胞染色体,其中具14条染色体的细胞占统计细胞总数的86.25%。染色体顺次C-分带与45S rDNA分子原位杂交（FISH）,结果表明,新麦草7对染色体可根据各自独特的带型而彼此区分开来。新麦草染色体组成为2n=2x=14=8m+6sm,核型对称类型属于2A。根据带型可以将7对染色体分为3组,同时也发现存在带型多态性。FISH结果显示45S rDNA在二倍体新麦草染色体上有6个主要分布位点,均位于染色体短臂端部,某些染色体中部和长臂末端也存在弱的杂交信号,可能属于次缢痕以外的rDNA分布位点。新麦草加倍细胞28条染色体上共存在12个主45S rDNA位点。顺次C-分带与原位杂交结果将3对45S rDNA位点初步定位于新麦草的Ⅰ、Ⅲ以及Ⅴ染色体短臂末端,推测这3对染色体可能是NOR染色体。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 植物多倍体育种的意义
• 1.2 牧草多倍体育种概况
• 1.3 多倍体诱导的常规方法
• 1.4 植物外植体培养与多倍体诱导
• 1.4.1 植物外植体培养技术的发展
• 1.4.2 植物组织培养技术在遗传育种领域的应用
• 1.4.3 牧草的组织培养研究
• 1.4.4 诱导植物离体组织染色体加倍
• 1.4.4.1 诱导材料和诱导方式
• 1.4.4.2 化学诱导剂类型
• 1.4.4.3 诱导离体多倍体的其它方法
• 1.5 染色体加倍植株的倍性鉴定
• 1.5.1 染色体直接计数法
• 1.5.2 扫描细胞光度仪鉴定
• 1.5.3 细胞形态学鉴定法
• 1.5.4 逆境胁迫法
• 1.5.5 植物形态学鉴定法
• 1.6 染色体加倍对植物光合与叶绿素荧光特性的影响
• 1.6.1 植物光合作用研究方法
• 1.6.2 植物光合作用与染色体倍性
• 1.7 染色体C-分带与荧光原位杂交在植物染色体分析中的应用
• 1.7.1 染色体C-分带技术
• 1.7.2 染色体荧光原位杂交（FISH）
• 1.7.2.1 植物FISH 的原理与应用
• 1.7.2.2 RDNA 分子原位杂交
• 1.8 新麦草属牧草研究概况
• 1.8.1 新麦草分类地位
• 1.8.2 新麦草的植物学特征与生物学特性
• 1.8.3 新麦草育种研究
• 1.8.4 新麦草外植体培养研究
• 1.8.5 新麦草的远缘杂交及细胞遗传学研究
• 1.9 研究目的与意义
• 第二章 新麦草外植体培养与高效再生体系建立
• 2.1 试验材料与方法
• 2.1.1 试验材料简介
• 2.1.2 愈伤组织诱导培养
• 2.1.2.1 幼胚
• 2.1.2.2 幼穗
• 2.1.2.3 成熟胚
• 2.1.3 愈伤组织继代培养
• 2.1.4 分化与再生培养
• 2.1.5 数据统计
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 外植体取材与筛选
• 2.2.1.1 幼穗成熟度对愈伤组织诱导的影响
• 2.2.1.2 幼胚胚龄及低温处理对愈伤组织诱导的影响
• 2.2.1.3 种子预处理对成熟胚愈伤组织诱导的影响
• 2.2.2 基本培养基筛选
• 2.2.3 外源激素对愈伤组织诱导的影响
• 2.2.3.1 生长素2,4-D 与细胞分裂素6-BA 及其互作
• 2.2.3.2 脱落酸（ABA）对愈伤组织诱导的影响
• 2.2.4 水解酪蛋白（CH）对愈伤组织培养的影响
• 2.2.5 愈伤组织的继代改造
• 2.2.6 愈伤组织的分化与再生
• 2.2.7 再生小植株生根与移栽
• 2.2.8 基因型差异对新麦草外植体培养的影响
• 2.2.9 新麦草三种外植体培养过程的比较
• 2.3 讨论与小结
• 第三章 新麦草染色体加倍与倍性鉴定
• 3.1 试验材料与方法
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 染色体加倍诱导方法
• 3.1.2.1 诱导萌动种子染色体加倍
• 3.1.2.2 诱导分蘖芽染色体加倍
• 3.1.2.3 诱导愈伤组织染色体加倍
• 3.1.3 加倍材料的倍性鉴定
• 3.1.3.1 根尖细胞染色体计数法
• 3.1.3.2 形态学鉴定
• 3.1.3.3 气孔保卫细胞鉴定
• 3.1.4 数据分析
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 诱导萌动种子染色体加倍
• 3.2.2 诱导分蘖芽染色体加倍
• 3.2.3 诱导愈伤组织染色体加倍
• 3.2.4 染色体计数倍性鉴定
• 3.2.5 染色体加倍植株形态鉴定
• 3.2.6 气孔保卫细胞比较
• 3.3 讨论与小结
• 第四章 新麦草加倍植株光合作用与叶绿素荧光分析
• 4.1 试验材料与方法
• 4.1.1 试验材料
• 4.1.2 试验方法
• 4.1.2.1 叶片光合作用光响应曲线测定
• 2响应曲线测定'>4.1.2.2 叶片光合作用CO₂响应曲线测定
• 2响应曲线拟合与参数估计'>4.1.2.3 光响应曲线和CO₂响应曲线拟合与参数估计
• 4.1.2.4 叶片叶绿素荧光参数对干旱胁迫的响应
• 4.1.2.5 数据统计分析
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 不同倍性植株叶片光合速率对光辐射强度的响应
• 2浓度及蒸腾速率对光强的响应'>4.2.2 气孔导度、胞间CO₂浓度及蒸腾速率对光强的响应
• 2浓度的响应'>4.2.3 光合速率对胞间CO₂浓度的响应
• 4.2.4 气孔导度、蒸腾速率及水分利用效率对胞间C02浓度的响应
• 4.2.5 叶绿素荧光对干旱胁迫的响应分析
• 4.3 讨论与小结
• 第五章 新麦草细胞学分析
• 5.1 试验材料与方法
• 5.1.1 试验材料
• 5.1.2 体细胞染色体数目统计
• 5.1.3 染色体C-分带及核型分析
• 5.1.4 染色体45S RDNA 分子原位杂交（FISH）
• 5.1.4.1 标记探针
• 5.1.4.2 染色体制片与变性
• 5.1.4.3 原位杂交
• 5.1.4.4 染色及镜检
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 染色体数目与形态
• 5.2.2 染色体C-分带与核型分析
• 5.2.3 染色体45SRDNA 分子原位杂交（FISH）
• 5.3 讨论与小结
• 第六章 综合讨论与结论
• 6.1 讨论
• 6.2 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附表
• 附图
• 作者简介