重组蓖麻毒素A链拮抗分子的设计

论文摘要

蓖麻毒素（ricin）是从植物蓖麻子中分离得到的一种Ⅱ型核糖体失活蛋白,其A链（RA）为效应链,具有N-糖苷酶活性,通过催化28S rRNA S/R结构域第4324位脱去一个保守的腺嘌呤,使核糖体60S亚基失活,从而阻断蛋白质合成途径引起细胞死亡。RA因其高细胞毒性,常常用于制备免疫毒素药物（ITs）,尤其在恶性肿瘤的生物治疗上具有诱人的应用前景;或可能被用作恐怖袭击的生物战剂。然而,由于RA对哺乳动物细胞的非特异性杀伤作用,不可避免出现一些治疗副反应,如血管渗漏综合症等。研制针对RA的拮抗分子,有助于缓解这些临床副作用,并对蓖麻毒素生物恐怖袭击的侦检、治疗及预防提供必要的理论与实验依据。 本研究基于RA与底物相互作用复合物的晶体结构,通过计算机辅助分子设计（CAMD）的方法合理设计了两类针对RA的拮抗分子,即拮抗肽PT,以及在CDR3区插入拮抗肽的重组人重链单域抗体(rVHPT)。研究内容概要如下:1.对重组蓖麻毒素A链基因进行了成功的克隆、表达、纯化以及功能鉴定,建立了用于筛选RA拮抗分子的生物学评价平台,即体外细胞毒性实验与无细胞系中荧光素酶蛋白合成抑制实验。2.基于RA的晶体结构信息与定点突变实验,初步确定以四个氨基酸残基（E177,R180,Y80,Y123）为主的RA生物活性功能域。针对这一结构域,合理设计了两类RA拮抗分子,即PT与rVHPT,理论模拟的结果显示它们能明显阻断RA-rRNA相互作用。3.分别制备合成PT、原核表达rVHPT,并进行竞争ELISA实验,结果表明二者均能显著竞争抑制rRA与其相应抗体的结合。无细胞系中荧光素酶蛋白合成抑制实验的结果表明,给予50%蛋白合成抑制率的rRA用量时,0.1 mg/mL的PT即能使蛋白合成率恢复至80%以上。而体外细胞毒性实验也表明,rVHPT能显著抑

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 重组蓖麻毒素A链（rRA）的克隆、表达、纯化及活性研究
• 第一章 重组蓖麻毒素A链（rRA）的克隆、融合表达、纯化与鉴定
• 材料
• 方法
• 结果
• 第二章 用于筛选rRA拮抗分子的生物学功能评价平台的建立
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 重组蓖麻毒素A链（rRA）拮抗分子的合理设计及生物学评价
• 第一章 重组蓖麻毒素A链（rRA）拮抗分子的合理设计
• 材料
• 方法
• 结果
• 第二章 小分子拮抗肽（PT）与重组人单域抗体（rVH）的合成与制备
• 材料
• 方法
• 结果
• 第三章 小分子拮抗肽（PT）与重组人单域抗体（rVH）的生物学评价
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 总结
• 参考文献
• 致谢
• 文献综述
• 附录1
• 附录2