季铵盐类大黄素衍生物体外抗癌活性研究及诱导凋亡作用探讨

论文摘要

目的：研究季铵盐类大黄素衍生物的体外抗癌活性,筛选出高效低毒的化合物,探讨其抗癌作用的机制,为蒽醌类药物的研发提供理论参考。方法：采用MTT法对一系列季铵盐类大黄素衍生物进行体外细胞毒性实验,测试化合物对人恶性黑色素瘤细胞株A375、人胃腺癌细胞株BGC-823、人肝癌细胞株HepG2及正常人胚肺成纤维细胞株HELF的增殖抑制作用,并进行构效关系分析,筛选高效低毒的化合物。采用普通倒置显微镜观察、AO/EB和DAPI分别染色后荧光显微镜观察的方法,研究药物作用后细胞的形态学变化；采用线粒体荧光染料染色法,利用激光共聚焦显微镜观察药物的亚细胞定位；采用DiOC6染色法,利用流式细胞仪检测药物作用后线粒体膜电位的变化；利用活性氧（ROS）检测试剂盒检测药物作用对细胞内ROS水平的影响;利用Western Blot技术检测药物对抗凋亡蛋白Bcl-2表达量的影响。结果：MTT结果显示,与母体大黄素相比,其结构修饰物的抗癌活性都有不同程度的增强。1,3,8位被甲基或乙基取代、长碳链连在3-OH或季铵盐的N原子上以及3-OH上连长链或短链的化合物之间抗癌活性区别不大,但1,8位取代基位置不同对抗癌活性有影响；季铵盐上碳链的长度、数目对抗癌活性影响较大,中等长度的碳链化合物抗癌作用比较好,其中化合物11c和13a对癌细胞IC50值<5μM,对正常细胞IC50值>10μM。细胞对季铵盐类大黄素衍生物的敏感程度不同,由强到弱依次为A375>BGC-823>HepG2>HELF。普通倒置显微镜观察法、AO/EB及DAPI染色法验证了化合物11c、13a都能诱导A375细胞出现细胞形态不完整、染色质浓缩等细胞凋亡形态学改变；激光共聚焦显微镜观察药物部分定位于线粒体内；流式细胞仪分析发现线粒体膜电位下降,ROS水平升高；两种化合物还都能导致Bcl-2蛋白表达量降低。结论：季铵盐类大黄素衍生物具有较好的体外抗癌活性,化合物11c、13a通过下调Bcl-2蛋白水平,定位于线粒体内,使细胞内ROS水平升高,线粒体膜电位降低,介导了A375细胞凋亡直至死亡。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 主要符号表
• 第一章 前言
• 1.1 癌症的研究进展
• 1.1.1 癌症近况
• 1.1.2 癌症的发生
• 1.1.3 癌症的治疗
• 1.2 大黄素及其衍生物的研究进展
• 1.2.1 大黄素的药理活性
• 1.2.1.1 泻下作用
• 1.2.1.2 抗微生物活性
• 1.2.1.3 抗炎作用
• 1.2.1.4 抗氧化作用
• 1.2.1.5 抗肿瘤作用
• 1.2.1.6 其他作用
• 1.2.2 大黄素衍生物的合成进展
• 1.2.2.1 大黄素3位羟基的修饰
• 1.2.2.2 大黄素6位甲基的修饰
• 1.2.2.3 大黄素2位的修饰
• 1.2.2.4 大黄素4位的修饰
• 1.2.2.5 大黄素金属络合物
• 1.2.2.6 其他位点的修饰
• 1.2.3 大黄素及其衍生物的抗癌作用机制
• 1.3 本论文的主要研究内容及创新点
• 1.3.1 论文的主要研究内容
• 1.3.2 论文的创新点
• 第二章 季铵盐类大黄素衍生物体外抗癌活性研究
• 2.1. 实验材料与仪器
• 2.1.1 主要的实验药品与试剂
• 2.1.2 主要的仪器设备与耗材
• 2.1.3 常用溶液的配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 细胞培养
• 2.2.2 大黄素及其衍生物细胞毒性实验
• 2.2.3 大黄素衍生物作用前后的细胞形态学观察
• 2.2.4 统计学分析
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 季铵盐类大黄素衍生物的细胞毒性作用
• 2.3.1.1 化合物的细胞毒性作用及构效关系
• 2.3.1.2 化合物11c的细胞毒性作用
• 2.3.1.3 化合物13a的细胞毒性作用
• 2.3.2 大黄素衍生物作用前后的细胞形态学观察
• 2.3.2.1 化合物11c对细胞形态学的影响
• 2.3.2.2 化合物13a对细胞形态学的影响
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 大黄素衍生物抗癌作用机制研究
• 3.1 实验材料与仪器
• 3.1.1 主要的实验药品与试剂
• 3.1.2 主要的仪器设备与耗材
• 3.1.3 常用试剂的配制
• 3.1.3.1 细胞培养相关试剂
• 3.1.3.2 线粒体膜电位试剂配制
• 3.1.3.3 Western Blot实验相关试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 AO/EB染色法检测细胞凋亡与坏死
• 3.2.2 DAPI染色法检测细胞凋亡
• 3.2.3 细胞亚细胞器定位
• 3.2.4 活性氧（ROS）水平检测
• 3.2.5 线粒体膜电位（△Ψm）检测
• 3.2.6 Western Blot检测蛋白量变化
• 3.2.6.1 细胞蛋白提取
• 3.2.6.2 BCA法测定蛋白浓度
• 3.2.6.3 SDS-PAGE凝胶电泳
• 3.2.6.4 湿转转膜
• 3.2.6.5 封闭及抗体孵育
• 3.2.6.6 DAB显色
• 3.2.7 统计学处理
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 AO/EB染色法检测细胞凋亡
• 3.3.1.1 化合物11c作用后细胞形态学变化
• 3.3.1.2 化合物13a作用后细胞形态学变化
• 3.3.2 DAPI染色法检测细胞凋亡
• 3.3.2.1 化合物11c作用后细胞核形态学变化
• 3.3.2.2 化合物13a作用后细胞核形态学变化
• 3.3.3 药物在细胞器内的分布
• 3.3.3.1 化合物11c作用后的线粒体定位
• 3.3.3.2 化合物13a作用后的线粒体定位
• 3.3.4 细胞内ROS水平变化
• 3.3.4.1 化合物11c作用后ROS水平变化
• 3.3.4.2 化合物13a作用后ROS水平变化
• 3.3.5 线粒体膜电位（△Ψm）变化
• 3.3.5.1 化合物11c作用后△Ψm变化
• 3.3.5.2 化合物13a作用后△Ψm变化
• 3.3.6 抗凋亡蛋白Bcl-2表达量变化
• 3.3.6.1 化合物11c对Bcl-2蛋白表达量的影响
• 3.3.6.2 化合物13a对Bcl-2蛋白表达量的影响
• 3.4 讨论
• 3.4.1 细胞形态学观察
• 3.4.2 亚细胞器定位
• 3.4.3 细胞内ROS水平变化
• 3.4.4 线粒体膜电位（△Ψm）变化
• 3.4.5 抗凋亡蛋白Bcl-2表达量变化
• 3.5 小结
• 结论
• 展望
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历