应用膜片钳技术对人食管下括约肌钙离子通道的研究

论文摘要

目的:医学界对食管下括约肌（lower esophageal sphincter, LES）是否存在及其结构特点的探讨经历了一个很长的发展过程。直到1979年,Liebermann-Meffert等学者通过对32例尸体标本的解剖研究,详细阐述了食管胃连接部（esophagogastric junction, EGJ）平滑肌束的宏观排列,提出人类LES的肌肉系统由套索纤维（sling fibers）和钩状纤维（clasp fibers）共同构成。钩状纤维位于LES右侧,呈半环形,套索纤维是一组不完整的U形肌束悬挂于胃食管交界部,食管下端的左侧,His角上方。它的开口侧位于胃小弯,闭口侧位于胃大弯。这两束肌肉共同维持LES的关闭状态,并形成了LES高压带（high-pressure zone, HPZ,1530mmHg）。这一理论为进一步研究LES的生理、病理和药理学特性奠定了基础。随后学者们主要对不同动物LES的生理学特点和功能调节进行了较为深入的探讨,发现LES具有明显不同于其它平滑肌结构的特性。而且更为重要的是,构成LES的套索纤维和钩状纤维在诸多方面也存在着很大的差异性。因此,LES结构或功能状态的异常是多种食管疾病的病理基础。现在一般认为,平滑肌细胞胞浆游离Ca2+在平滑肌收缩过程中起重要的“第二信使”作用。平滑肌细胞的收缩活动依赖胞浆中Ca2+的浓度,高浓度Ca2+引起平滑肌收缩,低浓度Ca2+引起平滑肌舒张。平滑肌收缩时的Ca2+来源于细胞外液Ca2+内流和细胞内钙库Ca2+释放（主要是肌质网,SR）。胞外Ca2+可通过质膜钙离子通道进入细胞;胞内Ca2+的释放也通过钙离子通道。钙离子通道存在于所有可兴奋细胞以及一些非兴奋细胞乃至原核生物。同骨骼肌、心肌类似,钙通道对内脏平滑肌细胞的舒缩起着举足轻重的作用。而平滑肌细胞膜L型钙通道在平滑肌兴奋-收缩耦联中起重要作用,当平滑肌细胞膜去极化时,通过L型钙通道流入细胞内的Ca2+是平滑肌细胞收缩的触发因素。本研究应用细胞膜片钳技术（patch clamp technique）对人类LES平滑肌细胞膜上钙离子通道的类型及常见的影响因素进行分析,并深入探讨构成LES的套索纤维和钩状纤维可能具有的不同生物学特征及其内在机制。可以设想,对LES的深入研究将大大有助于对贲门失弛症、食管下括约肌高压症等食管运动功能障碍性疾病,以及胃食管反流病（gastroesophageal reflux disease, GERD）等食管良性疾病病因和病理学的理解以及治疗方法的选择。方法:选取2007年1月至2007年12月在河北医科大学第四医院因食管中段癌行食管大部切除术患者22例,其中男性13例,女性9例,平均年龄57.3岁。手术室采集新鲜手术标本,锐性剥去胃贲门部及食管下段的粘膜层及粘膜下层后,制备套索纤维、钩状纤维的肌条,将肌条剪成2mm3的小块,用含胶原酶Ⅱ和木瓜酶的细胞分离液分离出单个平滑肌细胞。确认分离细胞活性在95%以上。然后用37℃Hepes缓冲液悬浮备用。细胞存活率测定:取5滴细胞悬浮液,加1滴0.2%的台盼蓝溶液,混匀3 min内计数,当细胞死亡时将被染成红色,活细胞无色。用以下公式计算细胞存活率:存活率（%）=活性细胞总数P/（活性细胞数+死细胞数）×100 %。将细胞灌流槽固定于倒置显微镜的工作台上,吸取急性分离的平滑肌细胞悬液数滴于灌流槽中,待细胞贴壁后,用钙电流相应的灌流液灌流,选取表面光洁、边缘整齐,光滑的,静止不动,立体感强的细胞为研究对象。记录电极由硬质玻璃毛坯经水平拉制仪（Sutter P-97, USA）四步拉制而成,内充钙离子电极内液后阻抗为23MΩ。采用三维液压微操纵器将电极靠近细胞进行封接,负压吸引致封接阻抗达1GΩ以上,吸破细胞膜,补偿电容电流和电极串联电阻,形成全细胞记录模式。脉冲信号由pulse+ pulsefit软件（HEKA, version 8.53,法耳次,德国）控制,通道信号经EPC-9膜片钳放大器（HEKA,法耳次,德国）放大,通过Ag-AgCl电极丝和填充电极内液的微电极导入细胞,产生的电流信号经EPC-9转换,为pulse+ pulsefit软件收集、分析,收集到的数据采用Origin 7.5拟合。所有实验在室温（25oC）下进行。所得数据以均数±标准差（x±s）表示,两组均数的比较用t检验进行统计学分析,通过软件SPSS 13.0 （SPSS公司,芝加哥,美国）完成。以P<0.05为差异在统计学上有显著性意义。结果: 1单个LES细胞的形状在倒置显微镜下,新鲜分离的食管下括约肌套索纤维及钩状纤维平滑肌细胞呈梭形,长短不一。在Hepes缓冲液中,部分平滑肌细胞完全舒张,部分处于不同程度的收缩状态,二者均有一个中心核（Fig. 23）。套索纤维细胞平均长度为101.1±27.2μm （51148μm,n=200）;钩状纤维平滑肌细胞长度为99.5±23.6μm（48～146μm,n=200）。二者比较无统计学意义P>0.05（t=0.247, P=0.676）。2 I-V曲线将细胞钳制在-60mV或-90mV,以10mV的阶跃刺激细胞去极化从-80+30mV,波宽为200ms。可记录到一内向电流,在刺激开始后513ms时出现,在I-V曲线中0mV达到峰值,在约-50mV处翻转。两者的IV曲线均呈U型,只不过峰值不同,在钳制电位为-60mV时为-5.58±1.53pA/Pf （n=6 cells）,显著低于钳制电位为-90mV的内向电流-7.02±0.93pA/pF （n=6 cells）,P<0.05（t=1.970, P=0.043）。并且套索纤维及钩状纤维平滑肌细胞的记录电流未发现不同。3 Nifedipine对内向电流的影响Nifedipine可显著抑制内向电流,钳制电压为-60mV和-90mV时,10μm Nifedipine几乎可完全取消内向电流（-0.44±0.73pA/pF&-1.47±1.23 pA/pF,n=6 cells）。和正常电流相比P<0.05（t=7.427, P=0.000&t=8.816, P=0.000）。在0.1、1、5μm时也发现相同的趋势。结论: 1.套索纤维和钩状纤维肌细胞形态类似,长度相当。2.人LES的内向电流主要通过L型钙通道,没证据表明除L型钙通道之外其他类型的钙通道存在。3. Nifedipine可显著抑制内向电流,而L型钙通道的特征之一就是对二氢吡啶类药物如Nifedipine的高敏感性。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究论文 应用膜片钳技术对人食管下括约肌钙离子通道的研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 人食管下括约肌钙离子通道的特点及调节机制
• 致谢
• 个人简历