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长穗偃麦草Na～+/H～+反向转运蛋白基因的分离与功能分析

2020-11-23阅读(318)

长穗偃麦草Na～+/H～+反向转运蛋白基因的分离与功能分析

论文摘要

盐胁迫是全世界范围内影响作物产量的最严重的非生物胁迫之一。利用基因工程提高植物的耐盐性,培育出能适合在盐渍化土地上生长的植物品种是有效利用盐渍化土地的主要方法。植物液泡膜Na+/H+反向转运蛋白能利用液泡膜上的H+-ATPase和H+-PPiase所产生的质子动力势将Na+区隔化在液泡内。这不仅能降低细胞质内的Na+浓度,还可以有效利用储存在液泡内的Na+作为渗透剂。已有研究表明过量表达液泡膜Na+/H+反向转运蛋白基因可以提高拟南芥、番茄等植物的耐盐性,说明液泡膜Na+/H+反向转运蛋白基因在植物的耐盐性中起着重要的作用。本研究首次从盐生单子叶植物长穗偃麦草中分离出液泡膜Na+/H+反向转运蛋白基因,并对该基因的表达和功能进行了全面地分析。首次将长穗偃麦草液泡膜Na+/H+反向转运蛋白基因导入禾本科草坪草高羊茅,转基因高羊茅耐盐能力显著提高。主要结果和结论如下:分别从长穗偃麦草的根和叶中克隆出两个Na+/H+反向转运蛋白基因,命名为AeNHX1（Acession Numeber:AF507044）和AeNHX2 （Acession Numeber:AY371178）。氨基酸序列分析和进化树分析表明它们与拟南芥、水稻、小麦等植物的液泡膜Na+/H+反向转运蛋白亲缘关系较近,而与拟南芥质膜Na+/H+反向转运蛋白亲缘关系较远。将AeNHX1-GFP融合蛋白在洋葱表皮细胞内瞬时表达。在洋葱表皮细胞的液泡膜上观察到绿色荧光,表明AeNHX1定位于液泡膜。Southern杂交结果发现AeNHX1在长穗偃麦草基因组中可能存在一个小的基因家族。Northern杂交结果表明AeNHX1基因特异性地在长穗偃麦草根中表达,并且它的表达不受盐胁迫的诱导,是一个组成型表达的基因。将AeNHX1插入酵母表达载体pYES2,转化酵母突变体ATX3,阳性转化菌落比对照菌落耐盐能力提高。AeNHX1还能拮抗Li+与潮霉素对酵母突变体的毒害作用,部分恢复酵母突变体对碱性阳离子敏感缺陷型。表明AeNHX1与酵母液泡膜Na+/H+反向转运蛋白ScNHX1,拟南芥液泡膜Na+/H+反向转运蛋白AtNHX1、AtNHX2具有相似的功

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 1 引言
  • 1.1 植物的耐盐性
  • 1.1.1 盐胁迫对植物的危害
  • 1.1.2 植物对盐胁迫的反应
  • 1.2 耐盐基因和耐盐基因工程
  • 1.2.1 渗透调节物质合成基因
  • 1.2.2 编码细胞保护蛋白的基因
  • 1.2.3 与细胞排毒、抗氧化防御能力相关的酶基因
  • 1.2.4 与信号转导和基因表达相关的调控基因
  • 1.2.5 维持细胞离子平衡的转运蛋白基因
  • +/H+反向转运蛋白'>1.3 Na+/H+反向转运蛋白
  • +/H+反向转运蛋白的结构特征'>1.3.1 Na+/H+反向转运蛋白的结构特征
  • +/H+ 反向转运蛋白基因 5051 及其调控途径'>1.3.2 质膜 Na+/H+ 反向转运蛋白基因 5051 及其调控途径
  • +/H+反向转运蛋白基因及其调控途径'>1.3.3 液泡膜Na+/H+反向转运蛋白基因及其调控途径
  • +/H+ 反向转运蛋白基因工程'>1.3.4 Na+/H+反向转运蛋白基因工程
  • 1.4 草坪草耐盐基因工程研究进展
  • 1.4.1 转化受体和转化方法
  • 1.4.2 禾本科草坪草耐盐基因工程
  • 2 材料与方法
  • 2.1 材料
  • 2.1.1 植物材料
  • 2.1.2 菌株与质粒
  • 2.1.3 酵母菌株和载体
  • 2.1.4 酶及生化试剂
  • 2.1.5 PCR引物
  • 2.2 实验方法
  • 2.2.1 总RNA 的提取
  • 2.2.2 RNA 纯化
  • 2.2.3 cDNA 第一条链的合成
  • 2.2.4 cDNA 纯化
  • 2.2.5 对cDNA 进行末端加尾
  • 2.2.6 植物基因组DNA 的提取
  • 2.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
  • 2.2.8 碱法小量质粒DNA 的提取
  • 2.2.9 DNA 序列测定
  • 2.2.10 根癌农杆菌GV3101 或C58C1 感受态细胞的制备与转化
  • 2.2.11 目的基因 AeNHX1 和AeNHX2 的分离
  • 2.2.12 凝胶电泳中DNA片段的回收
  • 2.2.13 Northern 杂交分析
  • 2.2.14 Southern 杂交分析
  • 2.2.15 AeNHX1-GFP 融合蛋白表达载体转化洋葱表皮细胞
  • 2.2.16 酵母表达载体的构建与转化
  • 2.2.17 拟南芥的无土栽培、转化及分析
  • 2.2.18 羊茅的转化与鉴定
  • 2.2.19 高羊茅耐盐实验
  • 2.2.20 光合速率的测定
  • 2.2.21 荧光参数测定
  • 2.2.22 叶片水势、饱和渗透势的测定
  • 2.2.23 离子含量的测定
  • 3 结果与分析
  • +/H+反向转运蛋白基因的分离及表达分析'>3.1 长穗偃麦草液泡膜Na+/H+反向转运蛋白基因的分离及表达分析
  • +/H+反向转运蛋白基因的分离'>3.1.1 长穗偃麦草液泡膜Na+/H+反向转运蛋白基因的分离
  • 3.1.2 AeNHX1和AeNHX2基因的序列分析
  • 3.1.3 AeNHX1-GFP 融合蛋白的亚细胞定位
  • 3.1.4 AeNHX1基因在长穗偃麦草中的表达分析
  • 3.1.5 AeNHX1互补酵母突变体ATX3碱性阳离子敏感缺陷型
  • 3.2 AeNHX1提高转基因植物的耐盐性
  • 3.2.1 AeNHX1提高转基因拟南芥的耐盐性
  • 3.2.2 AeNHX1 提高转基因高羊茅的耐盐性
  • 4 讨论
  • +/H+反向转运蛋白基因'>4.1 AeNHX1 是组成型表达的液泡膜Na+/H+反向转运蛋白基因
  • 4.2 过量表达AeNHX1能显著提高酵母、拟南芥和高羊茅的耐盐性
  • +/H+反向转运蛋白基因的耐盐基因工程策略'>4.3 Na+/H+反向转运蛋白基因的耐盐基因工程策略
  • 5 结论
  • 参考文献
  • 攻读学位期间发表论文情况
  • 致谢

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