鲤抗菌肽基因的克隆及其功能研究

论文摘要

抗菌肽（antibacterial peptide）又称为抗微生物肽或肽抗生素,是自然界中普遍存在的一类阳离子活性多肽,在细胞菌、植物、昆虫、鱼类、两栖类和哺乳类中均有分布,具有广谱杀菌作用,且不会产生耐受性,作为抵御病原体入侵的第一道防线,是机体非特异性免疫的重要组成部分。鱼类抗菌肽在国际近几年才开始进行研究,以色列学者Oren等首先从豹鳎（ Paradachirus marmoratus）体上分离到一种33个氨基酸残基的抗菌肽并命名为pardaxin。此肽具有螺旋——卷曲——螺旋的结构模式,具有比蜂毒素更强的抗菌活性和更低的人红血球溶血活性,其作用可与其它天然的抗菌肽如蛙皮素、杀菌肽等相比。电镜观察显示其抑菌的机制是溶解细菌的细胞壁。其后不同研究者分别从美洲拟鲽、七鳃鳗、泥鳅等多种鱼类中分离得到了不同鱼类抗菌肽。由于鱼类是适应性免疫防御刚刚开始出现的动物,其适应应性免疫防御机制尚不完善,鱼类所生活的水环境中存在大量细菌病原体,因而其天然免疫防御机制显得尤为重要。对鱼类抗菌肽的研究不仅有助于了解鱼类的天免疫机制,同时有助于我们在生产实践中寻找新的抗菌药物,提高鱼类的抗病性提供新的思路。本实验以新鲜的鲤为实验材料,用100%丙酮和90%甲醇配制的提取液,从新鲜鲤的鳃、皮肤、肝、肾组织中提取抗菌肽,并对鲤抗菌肽粗提物进行了部分性质检测。抑菌实验证明,鲤各组织提取物对大肠杆菌、鳗弧菌有较强的抑制作用,而对金黄色葡萄球菌的抑制效果不明显,并且不同组织的抑制作用有所差别。提取物经过加热处理后,抑菌圈略有变小。相反,经过胰蛋白酶处理后,抑菌圈略有变大。以上结果表明,鲤的多种组织中含有对细菌有抑制作用的抗菌肽。根据多种动物hepcidin cDNA序列比对结果,根据其保守区序列设计引物,利用RT-PCR方法克隆得到鲤hepcidin的cDNA片段,然后采用5`-RACE和3`-RACE技术得到其全长cDNA序列;采用以基因组DNA为模板,利用RT—PCR方法扩增得到了鲤鱼hepcidin的基因组DNA序列,对其内含子-外显子结构进行了分析。结果表明,鲤鱼hepcidin cDNA全长647 bp,由46 bp的5’非翻译区（5’-UTR）,276 bp的开放阅读框（ORF）和325 bp的3’非翻译区（3’-UTR）组成,其中ORF区编码91个氨基酸的前体hepcidin,由24个氨基酸残基的信号肽、42个氨基酸残基的前域和25个氨基酸残基的成熟肽组成。鲤鱼hepcidin成熟肽由25个氨基酸组成,含有8个保守的半胱氨酸残基,通过4个链内二硫键形成短的发卡结构,拐角处有一特殊的二硫键,可能与多肽的抗菌活性直接相关。鲤鱼hepcidin基因组DNA全长1209 bp,由三个外显子和两个内含子组成,外显子1编码部分5’-UTR、信号肽和部分前域,外显子2编码部分前域,外显子3编码部分前域、成熟肽和3’-UTR。采用RT-PCR方法检测了该基因mRNA在正常鲤鱼肝脏、脾脏、头肾、前肠、后肠、口腔上皮、鳃、皮肤、肌肉、性腺和血液等组织的分布,采用Real-time PCR技术检测了鳗弧菌浸泡刺激后鲤鱼肝脏、头肾、前肠和后肠中mRNA水平的变化。RT-PCR检测表明,在正常鲤鱼中,肝脏中hepcidin mRNA水平最高,其次为脾脏、后肠、头肾、前肠、口腔上皮、皮肤、性腺和血细胞,在鳃中的水平较低,而在肌肉中则未检测到其mRNA。Real-time PCR检测表明,鲤鱼经过鳗弧菌浸泡刺激后,各组织hepcidin mRNA水平整体呈现先升高后下降的趋势,但不同组织的变化模式并不相同。肝脏、头肾和后肠hepcidin mRNA水平在刺激后6 h就达到最大值,肝脏中约为正常水平的3倍,头肾和后肠可达到正常水平的17倍;前肠hepcidin mRNA水平在刺激后6 h开始升高,到72 h才达到最大值,约为正常水平的8倍。利用能够在毕氏酵母中特异表达的载体pPIC9K,构建了可以在E.coli和毕氏酵母中表达的穿梭质粒,转化E.coli后提取质粒并线性化,电转化毕氏酵母,在BMG培养基上筛选行到转鲤hepcidin基因的毕氏酵母菌,PCR鉴定结果显示hepcidin整合进入酵母基因组中。转hepcidin酵母经甲醇诱导表达并分泌到细胞外。抑菌活性实验表明,该抗菌肽对多种革兰氏阴性菌和阳性菌有抑菌活性,其中对水生生物学病原菌的抑菌活性强于其他生物来源的病原菌。成功获得了转hepcidin的酵母菌株。

论文目录

• 中文摘要
• 摘要
• Abstract
• 综述
• 1 抗菌肽的概念
• 2 抗菌肽的理化特性与结构
• 3 抗菌肽的生物活性及作用机理
• 4 抗菌肽的来源
• 5 鱼类抗菌肽研究概况
• 6 抗菌肽应用展望
• 7 选题依据及研究意义
• 正文
• 第一章 鲤不同组织抗菌肽的提取及活性检测
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 第二章 鲤抗菌肽hepcidin 基因的克隆与序列分析
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 第三章 鲤hepcidin 基因组 DNA 序列的克隆和基因结构的分析
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 第四章 鲤抗菌肽 Hepcidin 免疫功能研究
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 第五章 鲤hepcidin 在毕赤酵母中的表达及活性检测
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论著
• 致谢