人白细胞介素23基因克隆和携带EGFP腺病毒载体的构建与鉴定

论文摘要

胆管癌是一种高度恶性肿瘤,近年来发病率呈上升趋势。多数胆管癌患者在就诊时已是中晚期,仅有10%的患者能接受手术治疗,但手术切除后的远期效果亦不乐观。文献报告,欧美国家胆管癌术后5年生存率仅为5%13%。许多学者在深入进行胆管癌基础研究,不断改进手术方法的同时,积极探索胆管癌的各种综合治疗措施。其中基因免疫治疗被认为是继手术、放疗、化疗后的第四大肿瘤治疗模式而备受关注。胆管癌和其他肿瘤一样,复发转移的根本原因在于机体对肿瘤免疫防预能力的缺失,即肿瘤的免疫逃避机制,而免疫逃避的核心在于机体缺乏对肿瘤抗原的有效递呈并诱导特异性抗肿瘤免疫反应。肿瘤细胞多为弱免疫原性,缺乏主要组织相容性复合体分子、共刺激和粘附分子,因此难以激活机体的抗肿瘤免疫应答。近年来,免疫抗肿瘤研究最突出的进展之一是对机体内抗原递呈细胞（Antigen Presenting Cells,APC）的认识,其中树突状细胞（Dendritic cells, DC）是目前己知的体内功能最强大的专职抗原递呈细胞,是机体免疫应答的激发者,其最大的特点是既能刺激体内初始型T细胞增殖,又能有效地刺激宿主再次应答,被称为机体免疫系统的“哨兵”。而IL-23作为一种新发现的细胞因子,可增强DC在肿瘤环境中的生存力和对肿瘤抗原肽的递呈作用;IL-23还可促进活化的T细胞和记忆性T细胞增殖;诱导活化T细胞和DC产IFN-γ、IL-12等Th1型细胞因子,这类细胞因子是介导抗肿瘤细胞免疫的主要因素。已有动物实验证实,IL-23自身有显著抗肿瘤作用。LD等用编码单链IL-23（SCIL-23）的重组逆转录病毒载体转染小鼠结肠腺癌细胞系CT26（CT26/scIL-23）,大多数的荷瘤小鼠肿瘤消退,70%的小鼠能完全排斥肿瘤细胞的再冲击。Wang等用表达P19和P40的重组逆转录病毒转染结肠未分化腺癌细胞colon26（colon26/IL-23）,发现在有免疫活性的小鼠中,colon26瘤生长明显被抑制,随后消失。由此可见IL-23是一种潜在的抗肿瘤免疫佐剂,IL-23基因可成为抗肿瘤基因治疗的候选基因。保证IL-23基因在DC中持久高效表达,选择合适的转运载体十分重要。腺病毒载体是常用的基因转移载体,它具有转染效率高（分裂期与非分裂期细胞均可感染）;插入外源基因片段长;不整合入宿主细胞基因组;对机体毒性小等优点而被广泛用于基因治疗研究。本试验拟克隆人白介素23双亚基因P19和P40,利用Admax法构建携带hIL-23的复制缺陷型腺病毒载体,同时为了监控外源基因的表达,我们引入增强型绿色荧光蛋白（EGFP）,研究hIL-23在DC中的表达及对DC抗原递呈作用的影响,为进一步转染DC及胆管癌细胞提供理论和实验根据。目的:分别克隆人IL-23基因的双亚基P19cDNA和P40cDNA,构建含人IL-23基因的复制缺陷型腺病毒载体,为转染DC细胞和构建DC疫苗及其介导的治疗提供基础。方法:设计P19探针,从人骨髓细胞cDNA文库获得1个阳性克隆;从人白血病细胞K562总RNA中提取P40总RNA,RT-PCR法扩增P19和P40基因,酶切及测序鉴定。P19、P40及EGFP经IRES序列相连,片断回收后经酶切定向插入腺病毒穿梭质粒PDC-316载体,获得重组质粒pAdTrack-mCMV-P19-IRES-P40-GEFP。通过酶切、PCR对插入片断测序鉴定后,将该重组质粒和骨架腺病毒载体共转染HEK293细胞,利用AdMax系统进行腺病毒包装,通过观察EGFP的表达及PCR对腺病毒载体进行鉴定,利用EGFP及TCID50法进行病毒滴度及感染力分析。结果:P19和P40基因经测序和GENEBANK中序列完全一致,构建的PDC-316-P19-IRES-P40-GEFP经酶切得到1387bP的P19-IRES-P40片断。经转染包装,3天即见绿色荧光蛋白的表达,11天可见噬斑出现。电镜下可见在293细胞中病毒颗粒形成,双引物酶切鉴定,可扩增出特异性片段,而对照ade-EGFP则不能扩出目的基因片段。成功构建了含人IL-23和EGFP的腺病毒载体,纯化浓缩后的ade-IL-23-EGFP滴度可达6.5×109 Pfu/ ml。结论:成功克隆人的IL-23基因并构建人的IL-23的复制缺陷型腺病毒载体,为进一步转染DC并构建DC疫苗创造了条件。

论文目录

• 一、正文
• （一） 中文摘要
• （二） 英文摘要
• （三） 前言
• （四） 材料和方法
• （五） 结果
• （六） 讨论
• （七） 结论
• （八） 参考文献
• 二、文献综述
• （一） 综述
• （二） 参考文献
• 三、致谢