论文摘要
恶性肿瘤是一类严重危害人类生命和健康的疾病,寻求肿瘤早期诊断和有效预防治疗的方法和药物一直是生命科学家们追求的目标。在肿瘤相关的各类重要靶蛋白中,基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases,MMPs）在肿瘤的发生和发展中起着重要的作用。MMP14作为第一个鉴别出的膜型基质金属蛋白酶,它直接或间接降解细胞外基质中的多种成分,并对粘附分子有调节作用,被认为是MMPs家族中与肿瘤侵袭关系最密切的酶。本研究以雌二醇诱导表达MMP14蛋白的MG-63为起始细胞作用靶标,利用商品化噬菌体随机十二肽库对其进行细胞消减筛选,通过多轮筛选富集获得与靶标特异性结合的多肽,确定一致序列,并对其进行同源序列比对、分子模拟、金属离子亲和层析、体外细胞测定等分析,确定结合肽对MMP14和金属离子的双靶向性。研究结果表明,经过4-5轮的筛选,噬菌体得到有效富集,共获得8条新的序列,GenBank Blast未发现筛选获得的序列与已知的蛋白或结构域存在任何同源性,即为首次发现；结合实验室前期工作以MMP14蛋白催化结构域和差选方法筛选获得所有序列,对它们进行多序列比对、主观分类等显示可能的一致序列有：AHQ/SLH/P, HHXH, L/I/EPLL/I, MKPSR/MPKSR, K/RAPK/TS, ARXQ;分子模拟与对接进一步确认一致序列能与MMP14催化结构域的氨基酸120-125区域良好分子对接并具有一定的专一性,与MMP14的HX区域不能对接成功。由于对接位点正好处于MMP14的Zn离子结合区域,所以推断多条结合肽不权靶向MMP14同时结合金属离子,随后的金属离子亲和力测定实验也佐证了这一推断。细胞生物学研究确认所测定的含结合肽噬菌体对MG-63细胞的活力具有很好的抑制作用,并且合成的AHQLH、LPLL、MKPSR、DTARFQ一致序列多肽在μg级水平对MG-63细胞活力具有一定的抑制能力,呈现出明显的剂量依赖关系,其中AHQLH在浓度为10μg/ml下对细胞的抑制率即可达到41.6%。在此基础上加以改进设计的新型融合肽序列也较原先的抗菌肽序能够更好地抑制MG-63细胞的活力。为了进一步确认获得的一致序列对MMP14的靶向性,选取了能够表达MMP14蛋白的HEPG-2细胞和不能表达MMP14蛋白的Hela和MCF-7细胞分别作了细胞增殖MTT测定,结果显示所有合成的多肽一定程度上都能抑制HEPG-2细胞的活力但是对Hela细胞和MCF-7细胞的活力几乎没有影响,进一步佐证了我们获得的一致序列是通过作用于MMP14蛋白而抑制了肿瘤细胞的活力,后续的机理研究还在进展之中。这些新的和具有一定MMP14专一性的一致序列可望用于靶向MMP14抗肿瘤药物的研发和利用。
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标签：噬菌体随机十二肽库论文; 细胞消减筛选论文; 一致序列论文; 分子对接论文;