华山松大小蠹共生真菌秦岭细粘束孢漆酶特性研究

论文摘要

本文通过研究华山松大小蠹共生真菌秦岭细粘束孢产漆酶的条件,对漆酶分离纯化,研究漆酶性质,以及秦岭细粘束孢总DNA提取,漆酶基因的PCR扩增和序列分析,得出以下主要结论:1、运用单因素试验设定不同碳源、氮源、Cu2+浓度及底物浓度,结合愈创木酚法测定漆酶活性,并用SAS（V8.1）进行单因素方差分析研究不同培养条件对秦岭细粘束孢产漆酶的影响。试验结果表明,麦芽糖为秦岭细粘束孢产漆酶的最佳碳源;酵母为最佳氮源;随着Cu2+浓度的升高,明显诱导漆酶分泌,当Cu2+为0.6 mM时,漆酶酶活可达到292.36 IU/L,当Cu2+浓度升高到0.9 mM,对产酶起抑制作用,当Cu2+为0.9 mM时,培养初期几乎检测不到酶活;华山松韧皮部也可诱导漆酶分泌;随着培养天数的增加,酶活在第11 d出现峰值,随后下降。试验结果表明,不同培养条件对秦岭细粘束孢产漆酶的影响差异显著。同时,以麦芽糖为碳源,酵母为氮源,Cu2+为0.6 mM,华山松韧皮部组织为6 g/L,培养第11 d时,秦岭细粘束孢漆酶酶活可达到681.82 IU/L。2、通过透析浓缩,DEAE-纤维素（DE-52）柱层析（1.6 cm×26 cm）的方法从培养数天的秦岭细粘束孢培养液中分离纯化漆酶,得到了高活性的秦岭细粘束孢漆酶液,试验结果表明,通过纯化,秦岭细粘束孢漆酶活性达到5209.38 IU/L,比活力193.84 IU/mg,提纯倍数可达25.63。3、研究秦岭细粘束孢漆酶最适反应温度、热稳定性、最适反应pH、酸碱稳定性及金属离子耐受性,并用SAS（V8.1）对不同金属离子对漆酶的影响进行方差分析。试验结果表明,反应温度在35℃～45℃这一范围内变化时,相对酶活都能达到90%以上,高温不适合秦岭细粘束孢漆酶反应;其漆酶在25℃～45℃之间表现出较高的稳定性,之后温度越高,保温时间越长,漆酶越不稳定,酶活性越低;秦岭细粘束孢漆酶反应的最适pH为4.4, pH越接近这一值,酶活性也越高,越远离这一值,酶活性越低;其漆酶在pH3.6～pH4.4条件下,稳定性高,远离这一范围,保温时间越长,漆酶越不稳定;低浓度的Cu2+与Mg2+对秦岭细粘束孢漆酶活性没有显著影响,高浓度时会有极显著抑制漆酶活性的作用,低浓度或高浓度的Co2+、Mn2+、Ca2+、Na+、Fe2+等离子都会极显著的抑制漆酶活性。4、以秦岭细粘束孢总DNA为模板,PCR扩增出一段漆酶基因片段（150bp）,将目的片段核苷酸序列与GenBank上已报道的漆酶基因序列进行比对,并用ClustalX 2.0.10对目的片段核苷酸和其他6种与其相似度较高的漆酶基因进行同源性分析,以及TREECON for windows（version 1.3b）建立进化树状图。结果表明,目的片段核苷酸序列与已报道的多种菌漆酶基因都具有较高的相似性,所得目的片段的核苷酸序列与鹿胶角菌（Calocera viscosa）（EU882517.1）的进化距离最近,其次是与钩状木霉（Trichoderma hamatum）（FJ040333.1）、丝盖伞属（Inocybe）（EU88251.1）的进化距离较近,与产黄青霉（Penicillium chrysogenum）（XM 002567796.1）、黑曲霉（Aspergillus niger）（XM0013892）的进化距离都较远,与丛赤壳属（Nectria）（XM 003046649.1）的进化距离最远,且具有漆酶基因相似性真菌常见于腐木及植物残体中,与木质素的分解有关。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 小蠹虫
• 1.1.1 化学信息物对小蠹虫寄主选择与危害的调控
• 1.1.2 化学信息物在小蠹虫检疫与防治中的作用
• 1.1.3 小蠹虫与共生真菌
• 1.2 漆酶研究进展
• 1.2.1 漆酶的结构
• 1.2.2 漆酶催化机理的研究
• 1.2.3 漆酶的生理学研究
• 1.2.4 漆酶的纯化
• 1.2.5 漆酶的分子生物学研究
• 1.3 研究依据
• 第二章 秦岭细粘束孢产漆酶条件的研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 供试菌种
• 2.1.2 试验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 碳源对秦岭细粘束孢漆酶分泌的影响
• 2.2.2 氮源对漆酶分泌的影响
• 2.2.3 Cu2+浓度对漆酶分泌的影响
• 2.2.4 寄主组织对漆酶分泌的影响
• 2.2.5 培养时间对漆酶分泌的影响
• 2.3 结论与讨论
• 第三章 秦岭细粘束孢漆酶分离纯化及性质的研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 试验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 漆酶的分离纯化
• 3.2.2 酶学性质的测定
• 3.3 结论与讨论
• 第四章 秦岭细粘束孢漆酶基因片段分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试验材料
• 4.1.2 试验方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 秦岭细粘束孢总DNA 提取结果
• 4.2.2 PCR 扩增结果
• 4.2.3 测序结果
• 4.2.4 漆酶基因片段核苷酸序列相似性分析
• 4.3 结论与讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介