牛SYCP3基因的克隆、表达与启动子区甲基化分析

论文摘要

SYCP3蛋白是一种DNA结合蛋白,定位于联会复合体（SC）的侧成分（LEs）,在同源染色体的联会中起重要作用,是雄性精子发生过程中减数分裂步骤所必需的蛋白。SYCP3基因缺失或低表达所引起的精子发生障碍表型与实验室前期研究发现的犏牛（黄牛与牦牛种间杂交后代）雄性不育、减数分裂阻滞的表型是一致的。为进一步探究SYCP3基因的功能及其与犏牛雄性不育的关系,本文采用PCR扩增和克隆测序结束获得黄牛和牦牛bSYCP3基因序列,利用生物信息学方法对其基因结构、进化和系统发育进行了分析；采用RT-PCR和Real-time PCR技术分析了bSYCP3基因的组织表达特征,以及黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织bSYCP3基因的表达水平；扩增了黄牛和牦牛bSYCP3基因5’非翻译区序列,并采用亚硫酸氢盐测序技术分析了牦牛和犏牛睾丸组织中bSYCP3基因启动子区甲基化程度的差异,结果如下：1.黄牛、牦牛bSYCP3基因的克隆、序列分析及进化研究本文通过PCR扩增和克隆测序技术获得黄牛和牦牛bSYCP3基因序列,并将其命名为bSYCP3。黄牛和牦牛bSYCP3基因编码区序列全长为678bp,黄牛和牦牛的bSYCP3编码区同源性为100%,与其它哺乳动物相比也有较高的同源性（71%-83%）。牛bSYCP3基因由8个外显子和7个内含子组成,其中起始密码子位于第二外显子；电子染色体定位发现牛bSYCP3基因定位在5号染色体上。牛bSYCP3基因编码一个含有225个氨基酸残基的蛋白,bSYCP3蛋白含有一个典型的Corl基序和2个卷曲螺旋结构域（coiled-coil-forming）。bSYCP3蛋白氨基酸序列与哺乳动物其它物种的同源性为59-77%,在进化过程中受到负选择的影响。利用bSYCP3基因和Corl基序氨基酸序列构建的哺乳动物NJ树,结果均与经典生物分类方法一致。研究表明SYCP3基因在哺乳动物的进化上是保守的,推测bSYCP3蛋白生物学功能可能与其它哺乳动物SYCP3蛋白相似,即参与精子发生的减数分裂过程。2.黄牛、牦牛和犏牛bSYCP3基因的表达分析本文采用Real-time PCR对牛下丘脑、睾丸等组织bSYCP3基因的表达情况进行了分析,结果发现bSYCP3基因仅在牛睾丸组织中特异表达,与小鼠、大鼠等哺乳动物的研究结果相同,说明牛bSYCP3基因为睾丸组织特异表达的基因。实时荧光定量PCR显示,表现出雄性不育的犏牛睾丸组织中bSYCP3基因表达量极显著低于黄牛和牦牛（P<0.01）,而黄牛和牦牛之间差异不显著（P>0.05）。犏牛的精子发生障碍的表型与人、小鼠SYCP3基因表达缺失或降低引起的不育表型一致,据此推测bSYCP3基因在牛精子发生和减数分裂过程中发挥重要作用,且与犏牛雄性不育有一定的关系。3.牦牛和犏牛bSYCP3基因启动子区甲基化程度分析本文通过PCR扩增和克隆测序获得了bSYCP3基因的2271bp 5’非翻译区序列,并发现存在一个CpG岛,跨越了启动子区、第一外显子和第一内含子。转录结合因子位点分析发现bSYCP3基因核心启动子存在SP1等甲基化敏感位点,暗示DNA甲基化对bSYCP3基因的表达具有调控作用。采用亚硫酸氢盐测序技术分析了牦牛和犏牛睾丸组织中bSYCP3基因CpG岛中19个CpG位点的甲基化情况,结果发现牦牛睾丸组织中bSYCP3基因241bp启动子区的甲基化CpG位点占总CpG位点的81.58%（155/190）,犏牛的为86.84%（165/190）,犏牛的甲基化水平高于牦牛,但两者差异不显著（P>0.05）。在分析的19个CpG位点中的第7、13和17位CpG位点的甲基化水平在牦牛与犏牛间差异显著（P<0.05）,其中牦牛中甲基化的CpG位点占0（0/30）,而犏牛中却高达40%（12/30）。研究结果表明雄性犏牛bSYCP3基因启动子区的高甲基化水平与其mRNA低表达和雄性不育的表型是一致的,推测bSYCP3基因启动子的甲基化可能对其mRNA的表达调控起重要作用,且与犏牛精子发生减数分裂障碍和雄性不育有一定的关系。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 文献综述
• 第一章 牦牛与黄牛种间杂交研究进展
• 1 牦牛的杂种优势与杂交改良现状
• 2 犏牛雄性不育研究进展
• 2.1 形态学研究
• 2.2 组织解剖学研究
• 2.3 细胞遗传学研究
• 2.4 内分泌学研究
• 2.5 分子遗传学研究
• 2.6 表观遗传学研究
• 3 总结与展望
• 参考文献
• 第二章 雄性哺乳动物SYCP3基因研究进展
• 1 SYCP3基因的发现及命名
• 2 SYCP3结构及定位
• 2.1 哺乳动物中SYCP3基因的表达
• 2.2 SYCP3蛋白定位与结构
• 3 雄性哺乳动物中SYCP3蛋白生物功能
• 3.1 SYCP3蛋白构成精母细胞SC侧成分
• 3.2 SYCP3蛋白参与哺乳动物精子发生
• 4 总结与展望
• 参考文献
• 第二部分 实验研究
• 第三章 牛SYCP3基因的克隆与分析
• 1 材料与方法
• 1.1 实验动物及材料
• 1.2 睾丸组织样中RNA的提取
• 1.3 总RNA中mRNA反转录
• 1.4 引物设计与合成
• 1.5 PCR扩增反应
• 1.6 PCR产物回收及测序
• 1.7 序列的拼接与生物信息学分析
• 1.8 系统发育树的构建
• 2 结果与分析
• 2.1 黄牛、牦牛bSYCP3基因PCR扩增结果
• 2.2 bSYCP3基因编码区的序列分析
• 2.3 bSYCP3染色体定位和基因组结构分析
• 2.4 bSYCP3基因编码蛋白的结构特征分析
• 2.5 bSYCP3蛋白Cor1基序的三级结构预测
• 2.6 哺乳动物SYCP3基因编码区分子进化分析
• 2.7 bSYCP3基因Cor1基序分子进化研究
• 2.8 系统发育分析
• 3 讨论
• 参考文献
• 第四章 黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织bSYCP3基因mRNA表达水平分析
• 1 材料与方法
• 1.1 实验动物
• 1.2 组织样中RNA的提取
• 1.3 总RNA中mRNA反转录
• 1.4 引物设计与合成
• 1.5 bSYCP3基因的组织表达谱
• 1.6 Real-time PCR
• 2 结果与分析
• 2.1 bSYCP3基因及β-actin基因普通PCR扩增结果
• 2.2 bSYCP3基因的组织表达谱分析
• 2.3 黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织bSYCP3基因表达水平
• 3 讨论
• 参考文献
• 第五章 牦牛和犏牛睾丸组织bSYCP3基因启动子区甲基化分析
• 1 材料与方法
• 1.1 实验动物
• 1.2 组织样中DNA的提取
• 1.3 引物设计
• 1.4 PCR扩增
• 1.5 PCR产物回收及测序
• 1.6 序列的生物信息学分析
• 1.7 基因组DNA的亚硫酸氢钠修饰
• 1.8 BSP扩增反应
• 1.9 将BSP扩增产物连接到T载体上（TA克隆）
• 1.10 序列的比对及甲基化程度分析
• 2 结果与分析
• 2.1 bSYCP3基因5’-UTR克隆与测序
• 2.2 bSYCP3基因启动子区及CpG岛预测
• 2.3 bSYCP3基因BSP扩增结果
• 2.4 牦牛与犏牛睾丸组织bSYCP3基因启动子区甲基化分析
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文结论
• 全文创新
• 附录
• 致谢