芸薹属查尔酮异构酶基因家族的克隆与功能鉴定

论文摘要

甘蓝型油菜黄籽与黑籽相比较,具有种皮色素少、种皮薄、纤维素含量低以及蛋白质和含油量高的优点。通过远缘杂交等方法创造黄籽材料的选育周期长、效率低,尤其是黄籽表型易受环境影响而不稳定。作为类黄酮途径的第二步关键酶,查尔酮异构酶（CHI）催化四羟基查尔酮成为柚皮素,用于合成花青素苷、原花青素、黄酮醇、异黄酮、橙酮、黄烷酮等,它们对于植物的生长发育具有重要的生理功能,如异花授粉、种子保护与传播、抗病、抗逆、产量和品质。与甘蓝型油菜同属十字花科的模式生物拟南芥中,因查尔酮异构酶基因的功能失活性突变导致种皮颜色由野生型的深褐色变成黄色即透明种皮（transparent testa, tt）,定为tt5。此外,芸薹属内禹氏三角物种之间的关系,以及芸薹属与模式植物拟南芥之间可能的基因组“三倍化”关系,使芸薹属二倍体和四倍体物种以及与拟南芥一道,成为研究基因组进化、作物起源、性状形成方面最具吸引力的生物类群,围绕芸薹属植物的重要功能基因位点开展克隆和功能比较基因组学研究,将会为这些方面的理论研究提供新的证据。本研究主要基于RACE技术,分别从甘蓝型油菜和亲本物种白菜和甘蓝中克隆出CHI基因的全长cDNA和gDNA。Southern杂交进一步证明了CHI基因在这几个物种中的拷贝数。RT-PCR检测表明,芸薹属CHI基因家族的器官特异性与拟南芥CHI基因具有一些相似性,但成员间分化非常大。Southern杂交表明为单或双拷贝整合。以pFGC5941M为骨架,构建了它们的RNAi植物表达载体,转化甘蓝型油菜黑籽品种中双10号后获得一批转基因阳性植株。1)系统地克隆了甘蓝型油菜、白菜、甘蓝CHI基因家族采用RACE和PCR技术,以生殖器官的混合总RNA和基因组总DNA为材料,分别从甘蓝型油菜、白菜、甘蓝中克隆了CHI基因家族共14个成员基因的全长cDNA和gDNA。白菜CHI （BrCHI）基因家族：BrCHI1、BrCHI2、BrCHI3和BrCHI4基因全长分别为2093、1954、1761和1483bp,典型mRNA分别为1140、1120、1011和983 bp。甘蓝CHI（BoCHI）基因家族：BoCHI1、BoCHI2、BoCHI3和BoCHI4基因全长分别为1945、1941、1761和1516bp,典型mRNA分别为1034、1119、1016和986bp。甘蓝型油菜CHI（BnCHI）基因家族:BnCHI1、BnCHI2、BnCHI3、BnCHI4、BnCHI6和BnCHI7基因全长分别为1856、1937、1895、1762、1761和1483bp,典型mRNA（不计Ploy（A）尾巴,下同）分别为1042、1113、1042、1012、1016和983bp。2)芸薹属CHI基因家族编码蛋白的特征14个CHI蛋白大小为可以区分为两组,一组为234～252 aa,另一组为304 aa。分子量也相应的很为25.56～27.24 kDa和32.92～33.36 kDa。等电点除BrCHI3/BnCHI4和BoCHI3/BnCHI6为7.68碱性蛋白外,其余为4.84～6.96,为酸性蛋白。AtCHI为酸性蛋白,芸薹属CHI家族中除多数为酸性蛋白外,也产生了一些碱性CHI蛋白,功能是否有歧化有待后续验证。芸薹属CHI蛋白以及AtCHI蛋白互相间的进化关系同核苷酸水平的分析结果差别比较大。芸薹属CHI蛋白区分为2个组,组内成员间的相似性和一致性高于组间。芸薹属内14个CHI蛋白之间的一致性为50～100%,相似性为55.8～100%；它们与同科的拟南芥AtCHI蛋白一致性为54.1～80.3%,相似性为59.9～85.1%。BrCHI、BoCHI、BnCHI正常剪接编码的家族蛋白前体的二级结构中,α螺旋所占比重最大（35.53%-44.05%）,其次是随机卷曲（28.57%-33.88%）和延伸链（17.53%-21.71%）,β转角（5.58%-10.32%）所占比例最少少。根据Swiss-Model （Schwede et al.,2003）对BnCHI、BrCHI和BoCHI蛋白序列进行的三级结构预测得到的模型和紫花苜蓿（Medicago sativa）CHI（PDB ID:1jx0A）的空间结构相似。CHI的整体空间结构看起来向一个上下颠倒的花束,一个大的β折叠和和反面由3个短的β-折叠链连接的一层α-螺旋共同形成核心结构。3)芸薹属CHI基因数目的进化学含义白菜与甘蓝型油菜CHI基因的对应关系:BrCHI1/BnCHI3、BrCHI3/BnCHI4、BrCHI4/BnCHI7。甘蓝与甘蓝型油菜CHI基因的对应关系：BoCHI1/BnCHI1、BoCHI2/BnCHI2、BoCHI3/BnCHI6。蛋白系统发生分析进一步确认,BnCHI3、BnCHI4、BnCHI7分别来源于白菜的BrCHI1、BrCHI3、BrCHI4,而BnCHI1、BnCHI2、BnCHI6则分别来源于甘蓝的BoCHI1、BoCHI2、BoCHI3。理论预计,应该存在对应关系BrCHI2/BnCHI5和BoCHI4/BnCHI8,但是本实验没有克隆出完整的BnCHI5和BnCHI8gDNA和cDNA序列,RACE也没有克隆到相应的末端。但是BrCHl5与BoCHI2、BnCHI2相似性高达96.51%；BoCHI4与BrCHI4、BnCHI7一致性高达99.00%。推测BnCHI5与BnCHI8在甘蓝型油菜5B中也许因为某种原因丢失,属于异源多倍体中新近发生的冗余基因丢失现象,也许BnCHI5与BnCHI8并没有真正丢失,而是本研究尚未克隆出来而已。本研究表明,白菜、甘蓝、甘蓝型油菜中分别有4、4、6-8个CHI基因,基因数目、多重比对、系统发生分析表明,芸薹属祖先中发生了CHI基因的三倍化,而且随后一个成员又再次加倍。综上所述,CHI位点支持甘蓝型油菜是白菜和甘蓝的异源四倍体物种,而且支持芸薹属祖先相对拟南芥发生三倍化的假说。4)芸薹属CHI基因家族主要在蕾、花和幼种中表达,种间和成员间有一定差异BrCHI基因家族的总体表达在各组织器官中均有表达,存在一定的器官表达差异性。其中在生殖器官比在营养器官表达高,花、蕾和幼期种子最高,而根、茎和发育后期种子中表达低。BnCHI基因家族各成员间的表达特征差异明显：表达水平上,BrCHI1表达最高,BrCHI4最低；器官特异性上,BrCHI1主要在生殖器官中表达；BrCHI2主要在发育早期种子中表达：BrCHI3在叶、花、蕾和中期种子中表达；BrCHI4和BrCHI1相似,但在种子发育后期明显要高。BoCHI基因家族的总体表达情况与BrCHI相似。BnCHI基因家族各成员间的表达特征差异明显：表达水平上,BoCHI1表达最高,BoCHI4最低；器官特异性上,各成员差异明显,可能表示成员之间存在不同的功能分化。BoCHI1主要在生殖器官中表达；BoCHI2主要在发育早期种子中表达；BoCHI3在叶、花、蕾和中期种子中表达；BoCHI4和BoCHI1相似,但表达水平不如BoCHI1。BnCHI基因家族的总体表达在各组织器官的情况与BrCHI、BoCHI相似。BnCHI基因家族各成员间的表达特征差异明显：表达水平上,BnCHI1和BnCHI3表达最高,BnCHI5与BnCHI8没有检测到表达；器官特异性上,各成员差异明显,BnCHI1和BnCHI3主要在生殖器官——花、蕾、发育幼期种子——中表达,且器官差异性比较一致；BnCHI2主要只在花及发育早期种子中表达；BnCHI4和BnCHI6在叶、花、蕾和中期种子中表达,且在幼种中表达量比较低；BnCHI7与BnCHI1相似,但表达水平不如BnCHI。5)构建了芸薹属CHI基因家族的RNAi载体从甘蓝型油菜克隆了芸薹属CHI基因家族的干扰片段BCHII （761bp）,以改良后的pFGC5941为骨架载体,构建了11674bp的RNAi载体pFGC5941M-BCHII（简称pBCHII）,完成了分子鉴定,获得了其根癌农杆菌LBA4404工程菌株。6)芸薹属CHI基因家族表现出快速进化的特征核苷酸和蛋白水平的多重比对以及蛋白保守结构域预测表明,芸薹属内BrCHI、BoCHI、BnCHI基因家族成员均单一存在植物查尔酮异构酶结构域。芸薹属CHI基因家族成员明显可以划分为两个类型,四个亚类型。组内基因成员间的同源性远高于组间,而组间同源性高于与AtCHI间的同源性。基因的多重比较以及系统发生分析表明,芸薹属CHI基因起源于十字花科的祖先的一个CHI基因。然而,白菜、甘蓝等物种的CHI基因在其公共芸薹属祖先与拟南芥祖先分开后不久发生了三倍化加倍产生后,一个基因成员又在其后的某一时间白身加倍多产生了一条CHI基因,可能表明CHI基因在芸薹属物种类黄酮途径中有着重要的作用。在蛋白质基本性质分析上,BrCHI3/BnCHI4/BoCHI3/BnCHI6为弱碱性蛋白,IP为7.68,其余CHI蛋白为酸性蛋白,IP位于4.84～6.96间。在RT-PCR实验中,芸薹属CHI各成员表现出明显的组织器官差异。从BrCHI、BoCHI1、BnCHI基因家族RT-PCR结果推测：BrCHI1可能主要参与类黄酮物质的合成,影响花色和种皮色素；BrCHI2主要在发育早期种子中表达,可能主要参与种皮色素的形成；BrCHI3功能可能进一步歧化,可能会参与植株抗逆作用；BrCHI4与BrCHI1相似,但在种子发育后期明显要高,推测其功能在BnCHI1的基础上发生了进一步的歧化。BoCHI1可能主要参与类黄酮物质的合成,影响花色和种皮色素；BrCHI2可能受紫外线诱导或其它因素影响,主要参与种皮色素的形成；BoCHI3在叶、花、蕾和中期种子中表达,幼期种子中表达却很低,推测其功能发生歧化,可能参与植株的抗逆反应；BoCHI4和BoCHI1相似,但在种子发育中期其表达水平要高一些,推测其功能在BnCHI1的基础上发生了进一步的歧化。BnCHI1与BnCHI3存在相似的表达特异性,其可能机参与花色的形成又参与种皮色素的形成；BnCHI2重点参与种皮色素的形成,表达主要受紫外线诱导或者其他因素的影响,最有可能与植株的自我防护有关；BnCHI4与BnCHI6存在相似的表达特异性,在幼期种子中的表达相比较于蕾、花和后期种子表达水平下降,而在子叶和叶中表达水平却升高,推测其功能发生了歧化,可能参与植株的抗逆作用。而且,BnCHI4的表达水平比BnCHI6高,这也是成员分工的一个表现；BnCHI5与BnCHI8没有检测到表达；BnCHI7主要的生殖器官中表达,表达水平不高。7) RNAi转基因表明抑制芸薹属CHI同时影响种子大小、种皮色素、侧枝数等性状利用改良叶盘法,将RNA干扰载体pFGC5941M-BTT16I的工程菌株转化甘蓝型油菜型的黑籽品种中双10号的下胚轴,第一批获得了9株转基因阳性植株。在再生植株的生长发育过程中,系统地进行了性状观察。结果表明,RNA干扰抑制BnCHI基因家族后,转基因甘蓝型油菜的株高等生理特征没有明显变化,但在种皮色素、籽粒饱满度、侧枝数和花蕾的花瓣颜色上有明显差异。RNA干扰抑制阳性植株籽粒多不饱满,种皮色素明显降低,侧枝数相比对照减少1到2枝,而且在蕾期的早期,花瓣的颜色很明显的变浅。

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摘要

ABSTRACT

第一章文献综述

1.1 类黄酮物质特点及其在植物中的生理生化功能

1.2 类黄酮物质生物合成途径

1.2.1 类黄酮生物合成途径的分子生物学研究进展

1.3 TRANSPARENT TESTA5（TT5）基因特征及相关研究进展

1.4 芸薹科植物的比较基因组学研究

第二章引言

第三章材料与方法

3.1 菌株、载体和植物材料

3.1.1 植物材料

3.1.2 菌株和载体

3.2 主要仪器和设备

3.2.1 基本仪器设备

3.2.2 PCR扩增及产物检测仪器

3.2.3 细菌培养及亚克隆用仪器设备

3.2.4 Southern杂交仪器

3.3 试剂和试剂盒

3.3.1 主要分子生物学试剂

3.3.2 配制试剂

3.3.3 购买的试剂盒

3.4 植物材料的种植及取样

3.4.1 DNA材料

3.4.2 RNA材料

3.4.3 芸薹族材料基因组总DNA的粗提和纯化

3.5 芸薹属材料总RNA的提取

3.5.1 总RNA的提取

3.5.2 去除总RNA中DNA

3.6 CHI基因家族的RACE

3.6.1 RACE末端扩增引物设计

3.6.2 合成总cDNA的第一链

3.6.3 甘蓝型油菜、白菜、甘蓝CHI基因家族cDNA 5’末端的第一次扩增

3.6.4 甘蓝型油菜、白菜、甘蓝CHI基因家族cDNA 5’末端的第二次扩增

3.6.5 甘蓝型油菜、白菜、甘蓝CHI基因家族cDNA的3’末端一扩扩增

3.6.6 甘蓝型油菜、白菜、甘蓝CHI基因家族cDNA的3’末端第二次扩增

3.7 甘蓝型油菜、白菜、甘蓝CHI基因家族gDNA扩增

3.8 甘蓝型油菜、白菜、甘蓝CHI基因家族全长cDNA的扩增

3.9 胶回收、亚克隆、质粒抽提、测序和引物合成

3.9.1 琼脂糖凝胶电泳

3.9.2 目的片段胶回收

3.9.3 大肠杆菌DH5α和JM109感受态的制备

3.9.4 胶回收片段与丁载体连接

3.9.5 质粒DNA转化大肠杆菌

3.9.6 重组转化子的蓝白斑筛选及菌液PCR鉴定

3.9.7 转化重组子的质粒抽提

3.9.8 测序及引物合成

3.10 甘蓝CHI基因家族的Southern杂交分析

3.10.1 探针制备

3.10.2 基因组总DNA的限制性酶切消化

3.10.3 Southern杂交凝胶电泳

3.10.4 Southern杂交凝胶转膜及固定

3.10.5 探针与尼龙膜的Southern杂交和检测

3.10.6 剥离探针

3.11 核酸和蛋白序列的结构和功能的生物信息学分析

3.11.1 BnCHI、BrCHI和l BoCHI蛋白的系统发育分析

3.12 甘蓝型油菜、白菜、甘蓝CHI基因家族的RT-PCR分析

3.12.1 RNA的反转录

3.12.2 内标检测与cDNA浓度调节

3.12.3 甘蓝型油菜、白菜和甘蓝CHI基因半定量RT-PCR的引物和检测温度

3.12.4 不同组织器官中CHI基因家族各成员表达模式的半定量RT-PCR检测

3.12.5 CHI基因家族在黄、黑籽系间的表达差异性检测

3.13 芸薹属CHI基因家族RNAi载体的构建

3.13.1 RNAi载体构建所用引物

3.13.2 芸薹属CHI基因家族RNAi片段的克隆

3.13.3 载体骨架的制备和反义片段的插入

3.13.4 中间载体的酶切和正义片段的插入

3.13.5 RNAi载体转化根癌农杆菌

3.14 芸薹属CHI基因家族正义植物表达载体的构建

3.14.1 芸薹属CHI基因家族正义片段和植物表达载体骨架的制备

3.14.2 正义植物表达载体的构建与鉴定

3.15 甘蓝型油菜CHI基因家族RNAi载体的遗传转化

3.15.1 发无菌苗

3.15.2 预培养

3.15.3 侵染与共培养

3.15.4 杀农杆菌（洗外植体）与诱导抗性愈伤

3.15.5 分化培养

3.15.6 分化茎

3.15.7 长茎

3.15.8 生根

3.15.9 驯化及移栽

3.16 再生植株的分子检测和性状初步鉴定

3.16.1 Basta复检

3.16.2 PCR检测

3.16.3 性状调查

第四章结果与分析

4.1 各器官组织总RNA的提取和总cDNA的获得

4.1.1 白菜、甘蓝、甘蓝型油菜各器官组织RNA的提取

4.1.2 甘蓝型油菜、白菜、甘蓝生殖器官RACE总cDNA的获得

4.2 甘蓝型油菜、白菜、甘监基因组总DNA的提取

4.3 BrTT5、BoCHI、BnTT5基因家族gDNA的克隆

4.4 白菜、甘监、甘蓝型油菜CHI基因家族全长cDNA的克隆

4.5 BrTT5、BoTT5、BnCHI基因家族核酸水平的分析

4.5.1 BrTT5、BoTT5、BnCHI基因家族的基因结构和核酸特征

4.5.2 BrCHI、BoCHI、BnCHI基因家族核苷酸水平同源性和进化关系

4.6 芸薹属CHI基因家族编码蛋白的分析

4.6.1 BrCHI、BoCHI、BnCHI家族蛋白的基本参数

4.6.2 BrCHI、BoCHI、BnCHl家族蛋白的同源性

4.6.3 BrCHI、BoCHI、BnCHI家族蛋白的保守区域和活性中心预测

4.6.4 BrCHI、BoCHI、BnCHI家族蛋白的翻译后修饰及拓扑学预测

4.6.5 BrCHI、BoCHI、BnCHI家族蛋白的二级结构预测

4.6.6 BrCHI、BoCHI、BnCHI家族蛋白的三级结构预测

4.6.7 BnCHI、BrCHI和BoCHI蛋白的进化关系分析

4.7 BoCHI基因家族可能的成员数

4.8 BrCHI、BoCHI、BnCHI基因家族的表达特征

4.8.1 BrCHI基因家族的表达特征

4.8.2 BoCHI基因家族的表达特征

4.8.3 BnCHI基因家族成员的表达特征

4.9 BrCHI、BoCHI、BnCHI基因家族在黑、黄籽间的表达差异性

4.9.1 BrCHI基因家族在黑、黄籽材料中的表达差异分析

4.9.2 BoCHS基因家族在黑、黄籽材料中的表达差异分析

4.9.3 BnCHS基因家族在黑、黄籽材料中的表达差异分析

4.10 芸薹属CHI基因家族RNAi载体的构建

4.10.1 芸薹属CHI基因家族RNAi片段的克隆

4.10.2 反义片段的插入——中间载体的构建

4.10.3 正义片段的插入——RNA干扰载体的获得

4.10.4 转化农杆菌及菌株的PCR检测

4.11 CHI家族正义植物表达载体的构建

4.12 转RNAi载体的再生植株的分子检测和性状调查

4.12.1 再生植株的草甘膦（Basta）抗性复检结果

4.12.2 再生植株的PCR检测

4.12.3 再生植株的性状调查

第五章讨论与结论

5.1 系统克隆了白菜、甘蓝、甘蓝型油菜CHI基因家族

5.2 芸薹属CHI基因家族编码蛋白的特征

5.3 从CHI位点分析甘蓝型油菜、白菜、甘蓝之间的亲缘关系

5.4 芸薹属CHI基因家族经历了“三倍化”并进一步加倍

5.5 芸薹属CHI基因家族器官特异性的保守和歧化

5.6 本研究检测的芸薹属黄籽材料中CHI表达正常

5.7 芸薹属CHI基因家族表现出了快速进化的特征

5.8 RNAi转基因表明芸薹属CHI同时影响种皮色素、种子大小、侧枝数等性状

参考文献

致谢

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